兔出血症病毒WHNRH株全基因组测序全长cDNA克隆，VP60基因及全病毒真核表达载体构建

论文摘要

兔病毒性出血症是由兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起兔的一种急性、烈性、高致死性传染病，是一种毁灭性传染病，给养兔业造成巨大的经济损失。1984年我国首先爆发兔病毒性出血症，目前呈全国性分布，2004年GenBank登录了第一株中国株RHDV的全基因组序列，我国RHDV的分子流行病学资料非常缺乏，且迄今国内仍未见RHDV基因组序列测定的详细报道。目前国内外还没有RHDV反向遗传学和核酸疫苗的相关研究报道。鉴于此，本研究主要包括以下几个方面： 1．兔出血症病毒WHNRH株的分离鉴定：采用病死兔的肝脏组织进行病原的分离，将其经兔体传3代后接种兔呈规律性死亡和病理变化，其特征与兔病毒性出血症相同，采用氯仿处理，聚乙二醇沉淀法对第4代死亡兔肝脏组织进行处理，所得产物具有血凝特性，其血凝效价可达216，该血凝作用能够被抗RHDV的高免血清所抑制，该产物能够与抗RHDV的高免血清在琼脂扩散实验中形成清晰可见的沉淀线，将该液体经磷钨酸染色后进行电镜观察，结果发现该产物中存在一种大小约为30-40nm、无囊膜，符合RHDV形态特征的病毒粒子。参考GenBank中登录的兔出血症病毒的基因组序列，在保守区设计一对RHDV特异的PCR引物对该分离病毒进行RT-PCR扩增，结果扩增出与预期片段大小相符的PCR条带，对产物的克隆测序结果表明，该株病毒与已经报道的RHDV的对应区域的同源率达90.2％-97.2％，从分子水平证实本研究分离毒株为兔病毒性出血症病毒（RHDV），将其命名为WHNRH株。 2．兔出血症病毒WHNRH株基因组序列的测定与分析：采用片段重叠的

论文目录

• 目录
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• 常用的英文缩写词汇含义说明
• 前言
• 第一章 兔出血症病毒WHNRH株的分离鉴定
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 3.1 动物接种实验
• 3.2 血凝及血凝抑制实验
• 3.3 琼脂扩散试验
• 3.4 电镜观察
• 3.5 RT-PCR扩增及产物克隆测序
• 4 讨论
• 5 本章小结
• 第二章 兔出血症病毒WHNRH株全基因组序列的测定与分析
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 3.1 基因组内侧序列的RT-PCR扩增
• 3.2 基因组5'末端的获取
• 3.3 基因组3'末端的获取
• 3.4 基因组全序列测定结果及同源性分析
• 3.5 RHDV基因组ORF1编码多聚蛋白的氨基酸序列分析
• 3.6 RHDV基因组ORF2编码蛋白的氨基酸序列分析
• 3.7 RHDV基因组非编码区（UTR）的序列分析
• 3.8 RHDV WHNRH株衣壳蛋白VP60的生物信息学分析
• 4 讨论
• 5 本章小结
• 第三章 兔出血症病毒WHNRH株基因组的全长cDNA克隆
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 3.1 兔出血症病毒WHNRH株全长cDNA的RT-PCR扩增
• 3.2 兔出血症病毒WHNRH株全长cDNA T载体克隆的PCR鉴定
• 3.3 兔出血症病毒WHNRH株全长cDNA T载体克隆的酶切鉴定
• 3.4 兔出血症病毒WHNRH株全长cDNA克隆的序列测定
• 4 讨论
• 5 本章小结
• 第四章 兔出血症病毒WHNRH株VP60基因的克隆,VP60基因及全病毒真核表达载体的构建
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 3.1 衣壳蛋白基因（VP60）的PCR扩增及真核表达重组载体的构建
• 3.2 VP60基因的序列测定
• 3.3 分泌型真核表达载体中VP60的信号肽分析
• 3.4 衣壳蛋白VP60基因的突变位点的生物信息学分析
• 4 讨论
• 5 本章小结
• 结论
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介以及攻读博士学位期间发表的学术论文