论文摘要
由水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）引起的水稻条纹叶枯病是我国温带和亚热带稻区危害最严重的病毒病。感病品种的大面积栽培是造成该病害猖獗危害的主要因素之一。当前,抗病品种的严重匮乏是控制该病害的主要制约因素,而深入研究RSV与寄主水稻互作的分子机理是解决该问题的主要突破口之一。作者所在实验室基于Affymetrix水稻全基因组芯片已利用microarray技术对不同抗性水稻品种对RSV侵染在转录组学上的差异进行了分析,发现生长素信号传导参与了RSV与水稻互作的过程中。本论文以对RSV抗性存在显著差异的两个水稻品种（品系）——武育粳3号和KT95-418为研究材料,以RSV与水稻互作的转录组学microarray分析结果为研究基础,对RSV与抗病品种KT95-418互作中的生长素信号传导途径的相关基因进行了系统的研究。首先,建立了对不同寄主体内RSV编码的7个基因real-time RT-PCR标准检测体系。对RSV编码基因在水稻悬浮细胞和不同传毒效率灰飞虱体内的的表达变化进行了分析。确定了RSV编码的7个基因在水稻悬浮细胞内表达变化情况,结果显示RSV的复制酶基因RdRp最先到达表达高峰,其余6个基因（NS2、NSvc2、NS3、CP、SP和NSvc4）的RNA表达量均在RSV侵染后48 h达到高峰值。利用t-test对RSV 7个基因在RSV侵染水稻悬浮细胞后0、12、24、36、48和60 h表达变化的差异显著性进行分析表明:CP基因的RNA表达量变化是整个RSV侵染复制过程中最稳定的,其t值为1.35（P=0.40～0.20）。由此可见CP基因可以作为检测水稻悬浮细胞内RSV表达复制情况的分子标记。而RdRp基因的RNA表达量变化最显著,其t值为2.67（P=0.05～0.025）。对不同传毒效率灰飞虱单头虫体内RSV编码的7个基因的表达差异分析显示:NSvc2和NSvc4基因在虫体内的表达变化与介体的传毒能力呈正相关性,推测两者与灰飞虱的传毒特性相关。本研究还从细胞水稻揭示了武育粳3号和KT95-418对RSV的抗性差异。显示RSV在抗病品种KT95-418到达复制高峰需要较长的时间,且RSV的含量也低于武育粳3号水稻悬浮细胞的病毒含量。利用real-time RT-PCR和生物信息学的方法,对microarray分析结果中与生长素信号传导相关的基因进行验证和分析。确定在抗病品系KT95-418中,病株与健株相比,有4个生长素早期应答基因的mRNA表达存在差异,分别是OsSAuR基因家族中的OsSAuR1（LOCOs01g56240）、OsSAuR39（LOCOs09g37330）和OsSAuR53（LOCOs09g37480）基因以及Aux/IAA基因家族中的OsIAA31（LOCOs12g40900）基因。在感病品种武育粳3号中,发现5个生长素早期应答基因的mRNA表达存在差异,分别为Aux/IAA基因家族的OsIAA6（LOCOs01g53880）、OsIAA9（LOCOs02g56120）、OsIAA18（LOCOs05g44810）和OsIAA31（LOCOs12g40900）基因以及GH3基因家族中OsGH3-5基因（LOCOs05g50890）。其中OsIAA9和OsIAA31两个基因在两种水稻中均检测不到,推测可能两者mRNA含量非常少或者在植株中不转录。其它6个基因（OsIAA6、OsIAA18、OsGH3-5、OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53）在相应水稻品种的病健株内出现不同的差异表达。并且发现这些基因的表达在RSV侵染复制过程中发生动态变化。在水稻悬浮细胞内,这6个基因在RSV侵染细胞系0～64 h内均表达上调,而在RSV侵染水稻植株过程中均会出现一个短暂的表达上调高峰期（侵染后的4～8 d内）,侵染16 d后,每个基因的表达变化和microarray分析结果相近,此时,RSV侵染时间与microarray分析时的采样时间相一致。表明Microarray分析的具有较高的精确性和准确性。为了进一步确定生长素信号传导参与了RSV与水稻的互作过程,本研究利用real-time RT-PCR和高效液相色谱技术对RSV侵染水稻植株和水稻悬浮细胞后的生长素合成酶基因YUCAA1表达量和内源生长素含量的变化分别进行了测定。结果表明,在细胞水平,RSV侵染后的16～64 h内能显著引起YUCAA1基因mRNA表达量的上调和内源生长素含量的升高。与同一生长阶段的健康水稻相比,水稻植株接种后4～8 d内也可导致YUCAA1基因mRNA表达量的上调和内源生长素含量的上升,而在接种后12 d和16 d时,病株内的YUCAA1基因mRNA的表达量和内源生长素的含量均下降。这表明在RSV侵染水稻后的发病过程中,RSV能够调控寄主植物内源生长素的合成。但抗病品种KT95-418与感病品种武育粳3号相比,RSV侵染后,KT95-418内源生长素含量和YUCCA1mRNA表达量却低于武育粳3号病株内相应的含量。利用KPSC缓冲液处理病株来消除其内源生长素,能够引起RSV CP基因表达上调近3倍,而用30μM IAA溶液处理病株可使其体内的RSV CP基因表达下调45%,表明水稻体内生长素含量的变化能够影响RSV在寄主体内的复制。因为生长素受体蛋白形成的F-box可以影响到生长素早期反应基因的稳定性。而部分生长素早期反应基因（OsIAA6、OsIAA9、OsIAA18、OsIAA31、OsGH3-5和OsSAuR53）在RSV病株中出现表达下调。为进一步完善RSV与水稻互作过程中的生长素信号传导途径,特别是位于生长素信号传导途径上游的生长素受体基因的表达变化情况。因此,非常有必要确定水稻的生长素受体基因,并对其在RSV病健株内的表达变化进行分析。本研究通过生物信息学的方法,根据拟南芥生长素受体蛋白序列,推测了水稻生长素受体基因,并以水稻矮缩病毒（Ricedwarfvirus,RDV）病株为对照,利用real-time RT-PCR技术对其在RSV和RDV侵染过程的变化进行了分析。结果表明在水稻基因组数据库中共推测出3个基因可能为水稻生长素受体基因,分别命名为OsTIR1（LOCOs05g05800）、OsAFB1（LOCOs04g32460）和OsAFB2（LOCOs11g31620）。根据每个基因的cDNA序列和基因组DNA序列,设计其特异性引物,对每个基因在RSV和RDV侵染过程中的表达变化进行分析。发现RSV和RDV侵染均可引起OsTIR1和OsAFB1基因的表达上调,并导致OsAFB2基因的表达下调。由此可见,位于生长素早期反应基因上游的生长素受体基因也受到病毒侵染的影响而发生表达变化。由于本研究中没有对这3个基因进行克隆和表达,不能够从蛋白水平来揭示这些可能的受体蛋白在病毒侵染中的作用。但可以推测出可能是因为生长素受体蛋白影响到生长素早期反应基因的稳定性,导致RSV病株中生长素早期反应基因mRNA含量的下降。综合分析RSV与水稻互作转录组学的研究结果和real-time RT-PCR的验证结果,选取了在抗病品种KT95-418中特异表达差异的水稻OsSAuR基因家族中的3个基因OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53为研究对象,对其全长cDNA进行了克隆和编码蛋白进行表达,并对RSV病株内OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53蛋白的表达变化进行了分析。结果发现OsSAuR1基因全长276 bp,可编码93个氨基酸残基;OsSAuR39基因全长516 bp,可编码173个氨基酸残基;OsSAuR53基因全长435 bp,可编码145个氨基酸残基。通过比较其基因组DNA序列和mRNA序列发现这3个基因均没有内含子。构建pGEX系列的重组表达载体,在BL21中诱导表达GST融合蛋白,并通过免疫小白鼠制备每个融合蛋白的抗血清。利用制备的抗血清检测RSV侵染、生长素处理和蛋白酶抑制剂MG132处理等对每个蛋白表达的影响。发现在水稻健株、RSV病株和生长素处理的水稻植株中很难检测到OsSAuR1和OsSAuR39、OsSAuR53蛋白的存在。推测这3个蛋白在水稻中半衰期很短,以至于使其很快就降解了,或者本身表达非常微弱或者不表达。但通过蛋白酶抑制剂处理,可提高OsSAuR1、OsSAuR53和OsSAuR39蛋白的稳定性,这暗示3者可能为泛素降解的蛋白底物。为进一步揭示3个水稻OsSAuRs基因的功能,本研究还构建了这3个蛋白与EGFP的融合蛋白,通过基因枪轰击,使其在洋葱表皮细胞内进行表达。在紫外和蓝光激发下观察,发现OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53蛋白均定位在细胞核内,表明这3个蛋白均为核蛋白。我们还构建了PKYLX-OsSAuR1、PKYLX-OsSAuR39和PKYLX-OsSAuR53等3个植物表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草K326。通过抗性筛选和GUS染色,初步筛选了33株OsSAuR1过量表达转基因烟草、36株OsSAuR39过量表达转基因烟草和21株OsSAuR53过量表达转基因烟草。与野生型烟草相比,33株pKYLX-OsSAuR1转基因烟草和36株pKYLX-OsSAuR39转基因烟草从分化、生根到发育为植株没有显现出任何表型差异。但pKYLX-OsSAuR39转基因烟草愈伤组织在分化过程,叶片发育较慢。表明水稻OsSAuR1和OsSAuR39在植物的生长发育中具有功能冗余。21株pKYLX-OsSAuR53转基因烟草在分化过程中,发现4株pKYLX-OsSAuR53转基因烟草分化的叶片白化或黄化,叶片叶缘扭曲,生长缓慢。烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）侵染3种转基因烟草后,并未引起TMV复制表达的显著差异和症状的差异。推测可能这3个蛋白在烟草中过量表达可能对TMV的侵染和复制增值不起作用。本文通过对生长素信号传导中的相关基因在RSV侵染复制过程的表达差异和功能验证,确定了生长素信号传导参与了RSV与水稻互作过程,抗病品种可通过抑制生长素信号传导提高抗病性。但在抗病水稻KT95-418中显现特异性表达差异的3个OsSAUR基因在烟草中过量表达没有影响TMV的侵染和复制。该研究结果为深入解析RSV的致病机理和水稻的抗性机制提供了基本的理论依据。
论文目录
中文摘要Abstract1 前言1.1 水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）的研究概况1.1.1 水稻条纹叶枯病分布、危害及防治1.1.2 RSV的分类地位及病毒粒体形态1.1.3 RSV寄主范围及传播特性1.1.4 RSV致病性分化及品种抗性1.1.5 RSV的基因组结构与功能1.1.5.1 RNA1区段1.1.5.2 RNA2区段1.1.5.3 RNA3区段1.1.5.4 RNA4区段1.1.6 RSV的变异1.2 植物生长素信号传导途径的研究进展1.2.1 生长素在植物生长发育过程中的作用1.2.2 植物内源生长素的合成1.2.3 植物内源IAA的分布与运输1.2.4 生长素信号传导途径1.2.4.1 生长素早期反应基因家族1.2.4.2 生长素反应因子（auxinresponsivefactors,ARFs）1.2.4.3 植物生长素受体蛋白的确定TIR1蛋白复合体介导生长素信号传导'>1.2.4.4 SCFTIR1蛋白复合体介导生长素信号传导1.2.5 植物病原物与寄住互作中的生长素信号传导1.3 本研究的目的和意义2 Real-time RT-PCR在RSV定量检测中的建立和优化2.1 材料与方法2.1.1 材料2.1.1.1 植物材料和病毒毒源2.1.1.2 主要试剂和仪器2.1.2 RSV编码的7个基因在水稻悬浮细胞内的表达变化分析2.1.2.1 水稻悬浮细胞培养与RSV侵染2.1.2.2 引物设计2.1.2.3 总RNA提取2.1.2.4 Real-time RT-PCR检测2.1.2.5 数据分析2.1.3 不同传毒效率灰飞虱单头虫体内RSV编码基因的表达差异分析2.1.3.1 不同传毒能力灰飞虱种群的筛选和培育2.1.3.2 单头灰飞虱传毒能力的检测2.1.3.3 单头灰飞虱总RNA提取2.1.3.4 Real-time RT-PCR分析2.1.3.5 数据分析2.1.4 RSV在武育粳3号和KT95-418两种水稻悬浮细胞内复制变化2.1.4.1 病毒生物学测定2.1.4.2 水稻悬浮细胞培养与RSV侵染2.1.4.3 总RNA提取2.1.4.4 Real-time RT-PCR分析2.1.4.5 数据分析2.2 结果分析2.2.1 RSV7个基因的扩增及其引物特异性的分析2.2.2 RSV基因在水稻悬浮细胞内的RNA表达量的变化2.2.3 RSV基因在水稻悬浮细胞内的RNA表达量变化显著性分析2.2.4 RSV基因在不同传毒效率灰飞虱体内表达轮廓分析2.2.5 武育粳3号和KT95-418的病毒生物学特征2.2.6 武育粳3号和KT95-418悬浮细胞内CP基因表达差异的分析2.3 讨论2.3.1 Real-time RT-PCR对RSV病毒检测标准体系的建立2.3.2 RSV RdRp基因对RSV的复制可能起关键作用2.3.3 RSV CP基因可以作为检测RSV的分子标记2.3.4 NSvc2、NSvc4和SP基因可能参与了病毒的胞间运动和介体传毒2.3.5 NS3基因可能为RSV的基因沉默抑制子2.3.6 real-time RT-PCR技术可以作为传统品种抗病性鉴定的验证手段3 RSV侵染水稻过程中生长素信号传导途径相关基因的验证3.1 材料与方法3.1.1 材料3.1.1.1 植物材料和病毒毒源3.1.1.2 主要试剂与仪器3.1.2 方法3.1.2.1 水稻种子处理与育苗3.1.2.2 RSV病毒接种3.1.2.3 总RNA提取3.1.2.4 引物设计与合成3.1.2.5 Real-time RT-PCR检测3.1.2.6 数据分析3.2 结果分析3.2.1 生长素信号传导中相关基因的引物特异性分析3.2.2 生长素信号传导中相关基因的标准曲线的建立3.2.3 RSV侵染水稻悬浮细胞过程中生长素信号传导中相关基因的表达变化3.2.4 RSV侵染水稻植株发病过程中生长素部分早期应答基因的表达变化3.3 讨论3.3.1 基因芯片的分析结果只反映了RSV侵染水稻发病后时期相关基因转录水平的变化3.3.2 RSV侵染能够显著引起这些生长素信号传导途径早期应答基因mRNA的上调3.3.3 病毒侵染与不同生理条件下的比较3.3.4 抗病水稻与感病水稻在生长素早期反应基因表达上的比较4 RSV侵染对水稻内源生长素合成的影响和外源生长素对RSV复制的影响4.1 材料与方法:4.1.1 材料4.1.1.1 植物材料和病毒毒源4.1.1.2 试剂与仪器4.1.2 方法4.1.2.1 病毒接种与样品处理4.1.2.2 水稻悬浮细胞培养与RSV侵染4.1.2.3 引物设计4.1.2.4 总RNA提取4.1.2.5 real-time RT-PCR检测4.1.2.6 数据分析4.1.2.7 内源生长素的HPLC测定4.2 结果分析4.2.1 生长素合成酶基因YUCAA1引物特异性验证与real-time RT-PCR精确性检验4.2.2 RSV侵染对生长素合成酶基因表达的影响4.2.3 RSV侵染对水稻内源生长素的影响4.2.4 不同处理植株中RSV复制变化4.3 讨论4.3.1 生长素信号传导参与了病原物与寄主互作过程4.3.2 RSV侵染能够引起水稻内源生长素含量的增加4.3.3 外施生长素可抑制RSV在植株内的复制5 水稻生长素受体基因在RSV侵染后的差异表达5.1 材料与方法5.1.1 材料5.1.1.1 植物材料和病毒毒源5.1.1.2 试剂与仪器5.1.2 方法5.1.2.1 水稻生长素受体蛋白的推测5.1.2.2 序列分析5.1.2.3 系统进化分析5.1.2.4 病毒接种5.1.2.5 引物设计5.1.2.6 总RNA提取5.1.2.7 real-time RT-PCR检测5.1.2.8 数据分析5.2 结果分析5.2.1 水稻生长素受体基因的推测5.2.2 基因组结构与染色体定位5.2.3 序列与系统进化分析5.2.4 水稻生长素受体基因的引物特异性分析与精确性验证5.2.5 RSV和RDV侵染后水稻生长素受体基因的差异表达5.3 讨论6 RSV与水稻互作中生长素信号传导相关基因的克隆与表达6.1 研究材料6.1.1 植物材料、菌种与载体6.1.2 主要试剂与仪器6.1.3 供试植物处理6.2 研究方法6.2.1 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53基因的克隆6.2.1.1 引物设计6.2.1.2 总RNA提取6.2.1.3 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）6.2.1.4 DNA片段的切胶纯化6.2.1.5 PCR扩增产物和pMD18-T克隆载体的连接6.2.1.6 感受态细胞的制备6.2.1.7 连接反应物对宿主感受态细胞的转化6.2.1.8 碱裂解法小量提取质粒6.2.1.9 重组克隆的PCR筛选6.2.1.10 重组克隆的酶切鉴定6.2.1.11 序列测定与分析6.2.2 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53蛋白的原核表达6.2.2.1 目的片段与pGEX-4T-3载体的酶切回收6.2.2.2 目的片段与pGEX-4T-3载体连接转化6.2.2.3 重组质粒的提取与鉴定6.2.2.4 将测序正确的重组质粒转化BE21细胞6.2.3.5 融合蛋白的诱导表达6.2.3.6 蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳6.2.3.7 重组蛋白包涵体的纯化和复性6.2.3.8 融合蛋白的抗血清制备6.2.3.9 采用间接ELISA法测定抗血清效价6.2.3.10 Western blot鉴定6.2.3.11 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53基因上游序列和下游序列调控元件分析6.2.3.12 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53蛋白的生物信息学6.2.4 生物胁迫和非生物胁迫对水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53蛋白表达的影响6.2.4.1 RSV侵染对水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53蛋白表达的影响6.2.4.2 外源生长素处理对水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53 mRNA转录和蛋白表达的影响6.2.4.3 MG132处理对水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53蛋白表达的影响6.3 结果分析6.3.1 SAuRs基因的RT-PCR扩增结果6.3.2 SAuRs基因的克隆重组质粒酶切鉴定6.3.3 水稻SAuRs基因的序列分析6.3.4 水稻3个SAuRs基因的原核表达载体的酶切鉴定6.3.5 水稻3个OsSAuRs蛋白的诱导表达6.3.6 OsSAuRs蛋白的抗血清制备及效价测定6.3.7 水稻OsSAuRs蛋白抗血清特异性的鉴定6.3.8 OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53的生物信息学分析6.3.9 RSV侵染对水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53蛋白表达的影响6.3.10 生长素处理对水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53蛋白表达的影响6.3.11 MG132处理对OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53融合蛋白降解的影响6.4 讨论6.4.1 外源生长素处理水稻幼苗可显著提高OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53基因的mRNA含量6.4.2 OsSAuR39和OsSAuR53基因是水稻OsSAuRs基因家族成员6.4.3 OsSAuR53蛋白在RSV病株中高效表达7 水稻3个OsSAuRs蛋白的亚细胞定位及功能验证7.1 研究材料7.1.1 植物材料、菌种与载体7.1.2 主要试剂与仪器7.2 方法7.2.1 引物设计与合成7.2.2 用于亚细胞定位的重组表达载体构建与细胞转化7.2.2.1 用于亚细胞定位的目的基因片段克隆7.2.2.2 pEGAD、pMD-S1、pMD-S39和pMD-S53质粒的酶切和连接7.2.2.3 用于亚细胞定位的重组表达质粒的鉴定7.2.2.4 待转化洋葱表皮的制备7.2.2.5 重组质粒转化洋葱表皮细胞7.2.2.6 亚细胞定位检测7.2.2.7 农杆菌EH105感受提细胞制备7.2.2.8 pEGAD-OsSAuR1、pEGAD-OsSAuR39和pEGAD-OsSAuR53转化农杆菌EH1057.2.2.9 重组根癌农杆菌EHA105的菌落PCR验证7.2.3 用于过量表达的重组表达载体构建及转化7.2.3.1 用于过量表达的目的基因片段克隆7.2.3.2 pKYLX71:35S2、pMD-S1、pMD-S39和pMD-S53质粒的酶切和连接7.2.3.3 用于亚细胞定位的重组表达质粒的鉴定7.2.3.4 pKYLX71-OsSAuR1、pKYLX71-OsSAuR39和pKYLX71-OsSAuR53转化农杆菌EH1057.2.3.5 重组根癌农杆菌EHA105的菌落PCR验证7.2.4 重组根癌农杆菌EHA105转化A.thaliana7.2.4.1 拟南芥植株的培养7.2.4.2 拟南芥浸花法转化7.2.4.3 转基因拟南芥的抗性筛选7.2.4.4 抗性拟南芥DNA提取7.2.4.5 抗性拟南芥PCR鉴定7.2.4.6 抗性拟南芥GUS染色7.2.5 重组根癌农杆菌EHA105叶盘侵染法转化烟草7.2.5.1 受体材料的准备7.2.5.2 农杆菌培养7.2.5.3 浸染7.2.5.4 选择培养7.2.5.5 继代选择培养7.2.5.6 生根培养7.2.5.7 转基因烟草的DNA提取7.2.5.8 转基因烟草的PCR鉴定7.2.5.9 转基因烟草GUS染色7.2.5.10 转基因烟草TMV接种试验7.3 结果分析7.3.1 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53蛋白的亚细胞定位7.3.1.1 OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53用于亚细胞定位的植物表达载体的构建7.3.1.2 用于亚细胞定位的重组植物表达载体转化农杆菌7.3.1.3 OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53 EGFP融合蛋白的亚细胞定位7.3.2 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53的功能验证7.3.2.1 pKYLX-OsSAuR1、pKYLX-OsSAuR39和pKYLX-OsSAuR53植物表达载体的构建7.3.2.2 pKYLX-OsSAuR1、pKYLX-OsSAuR39和pKYLX-OsSAuR53质粒转化农杆菌分析7.3.2.3 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53转基因烟草抗性筛选与验证7.3.2.4 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53转基因烟草表型分析7.3.2.5 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53基因在烟草中过量表达对TMV复制增值的影响7.3.2.6 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53转基因拟南芥抗性筛选与验证及表型分析7.4 讨论7.4.1 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53均为核定位蛋白7.4.2 OsSAuR1和OsSAuR39在拟南芥的生长和发育中具有功能冗余性7.4.3 OsSAuR53在植物的生长和发育中具有一定特殊的功能7.4.4 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53基因在烟草中过量表达对TMV复制增值没有影响8 结论与展望参考文献致谢
相关论文文献
标签：水稻条纹病毒论文; 生长素信号传导论文; 水稻论文; 基因论文;
