环境内分泌干扰物引致儿童性早熟的机理及其中药治疗研究

论文摘要

目的：探讨环境内分泌干扰物（Environmental endocrine disruptors，EEDs）与性早熟发病的关系，制定针对EEDs拟雌激素作用的以中药为主的治疗方案，并深入研究中药治疗的作用机理。方法：（1）运用反相高效液相色谱法检测73例性早熟患儿及年龄、性别匹配的38例正常儿童血清中数种有代表性的EEDs(包括：洗涤剂降解产物中的4-壬基酚（4-nonylphenol，4-NP）、有机氯农药DDT的代谢产物中的二氯二苯二氯乙烯（1，1-dichloro-2，2，bis（p-chlorophenyl）ethylene，p，p’-DDE）、塑料添加剂中的邻苯二甲酸-2-乙基己酯（di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP）的含量；同时测定性早熟患儿的靶器官发育指标，包括子宫、卵巢体积，骨密度及血清雌二醇E2水平。对两组儿童的EEDs血清含量进行分析，并将血清EEDs含量与靶器官发育指标进行相关性分析及多元线性回归分析。（2）以21d雌性SD大鼠为实验对象，选取4-NP、双酚A（bisphenol A，BPA）、DEHP为染毒物质，均设高中低剂量，并将4-NP和BPA以低剂量混合喂饲连续三天，于末次给药后24h处死。以子宫湿重、脏器系数、子宫内膜及平滑肌增生程度和细胞增殖核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的蛋白表达作为检测指标，采用单因素方差分析方法进行统计。（3）制定针对EEDs拟雌激素作用的中药治疗方案，治疗受EEDs暴露的性早熟患儿及染毒动物，以上述生殖器官及骨骼发育水平作为检测指标；并采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time FQ-PCR）及免疫组织化学方法（immunohistochemistry，IHC）检测靶器官雌激素受体α（estrogen receptor alpha，ERα）、雌激素受体β（estrogen receptor beta，ERβ）、表皮细胞生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和胰岛素样生长因子-1受体（insulin-like factor-1 receptor，IGF-1R）的基因和蛋白的表达情况，采用单因素方差分析及t检验进行统计分析。结果：（1）每一例正常儿童血清中均检测到一定含量的p，p’-DDE（14.93～40.39ng/ml），部分正常儿童血清中检测到一定含量的4-NP及DEHP（ND～6.77ng/ml，ND～17.61ng/ml）。性早熟患儿血清中4-NP含量（ND～16.68ng/ml）、p，p’-DDE含量（40.03～91.68ng/ml）及DEHP含量（ND～64.71ng/ml）显著高于正常儿童（P＜0.01）。性早熟患儿血清中4-NP与子宫体积、卵巢体积、骨密度均呈显著正相关（r=0.394，0.286，0.237；P＜0.01）；p，p’-DDE与子宫体积呈显著正相关（r=0.306；P＜0.01）。4-NP对子宫体积的作用强度明显高于p，p’-DDE。（2）染毒动物实验结果显示，高中剂量的4-NP（200mg/kg，100mg/kg）和BPA（600mg/kg，400mg/kg）能够使染毒动物的子宫湿重及脏器系数明显增加（P＜0.01），并且具有一定的剂量-效应关系；4-NP和BPA高中低三种剂量都能够使子宫内膜上皮增高，平滑肌增厚，PCNA蛋白表达增强（P＜0.05）。低剂量的4-NP（50mg/kg）和BPA（200mg/kg）混合喂饲后上述指标均较单独喂饲组显著增加（P＜0.01）。（3）第一部分筛查出的EEDs暴露水平增高的性早熟患儿经中药治疗三个月后，子宫体积、血清E2含量、骨矿含量、骨密度、血清骨钙素含量较治疗前明显减小或降低（P＜0.01）。4-NP和BPA染毒的实验动物经中药治疗后，所有治疗组的子宫湿重、脏器系数、骨密度、子宫内膜上皮高度、子宫平滑肌厚度及PCNA蛋白表达均比实验组明显降低（P＜0.05）。中药治疗方案能够显著下调ERα及ERβmRNA在子宫、乳腺和骨骺端的表达水平（P＜0.05），降低ERα及ERβ在子宫内膜上皮细胞、乳腺导管上皮细胞和骨骺端生长板软骨细胞的蛋白表达水平（P＜0.05）；能够显著下调EGFR mRNA在子宫、乳腺的表达水平（P＜0.05），降低EGFR在子宫内膜上皮细胞、乳腺导管上皮细胞的蛋白表达水平（P＜0.05）；能够显著下调IGF-1R mRNA在干骺端的表达水平（P＜0.05），降低IGF-1R在骨骺端生长板软骨细胞的蛋白表达水平（P＜0.05）。结论：（1）当前正常儿童已经较普遍地暴露于环境内分泌干扰物，只不过暴露程度比性早熟患儿略轻而已；EEDs暴露与儿童性早熟的发病有密切关系，是其重要的致病因素之一；不同种类的EEDs对靶器官的致病作用强度有所不同。（2）动物染毒实验进一步证实了EEDs的拟雌激素作用及其剂量-效应关系；进一步验证了临床研究结果及其推论，证实EEDs的暴露程度与性早熟发病有密切关系；不同种类EEDs之间可以发挥联合增效作用，暴露人群更易受到不良影响；为子宫营养试验提供了更为敏感的检测指标。（3）制定了针对EEDs拟雌激素作用的中药治疗方案；研究结果表明所用中药能够有效拮抗EEDs的雌激素样活性，明显减轻EEDs对机体性发育及骨骼发育造成的不良影响；能够显著下调靶细胞雌激素受体的表达水平，降低机体对EEDs作用的敏感性；能够显著下调靶细胞生长因子受体的表达水平，干扰交叉对话机制，进一步加强其对EEDs拟雌激素活性的拮抗作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 技术路线图
• 第一部分 EEDs与性早熟发病的相互关系
• 第一节 性早熟患儿及正常儿童血清中EEDs含量的检测及分析
• 第二节 性早熟患儿血清中EEDs含量与靶器官发育指标的相关性分析
• 第二部分 EEDs对实验动物生殖器官发育的拟雌激素作用及其协同作用
• 第一节 4-NP、BPA、DEHP的拟雌激素作用及量效关系的研究
• 第二节 不同EEDs之间的协同作用
• 第三部分 中药拮抗EEDs拟雌激素作用的机理研究
• 第一节 中药对暴露于EEDs的性早熟患儿性发育及骨骼发育变化的拮抗作用
• 第二节 中药对EEDs染毒动物性发育及骨骼发育变化的拮抗作用
• 第三节 中药对实验动物靶器官雌激素受体、生长因子受体的基因及其蛋白表达的影响
• 结论
• 参考文献
• 附录Ⅰ 环境内分泌干扰物与青春期发育异常
• 附录Ⅱ 性早熟患儿血清中环境内分泌干扰物的测定和分析
• 附录Ⅲ 性早熟患儿血清中四种环境内分泌干扰物的检测
• 在校期间发表文章及获奖情况
• 致谢