论文摘要
创伤性脑损伤（Traumatic Brain Injury TBI）致死、致残率高,严重威胁人类的生命与生存质量。颅脑损伤后药物治疗的匮乏始终是大家关注的焦点。到目前为止,已经完成和即将完成的数百种药物治疗颅脑损伤的临床多中心随机双盲研究的结果表明,还没有一种药物具有确切的临床疗效。而最近的大量动物实验研究表明促红细胞生成素（erythrooietin,EPO）对颅脑损伤有一定的疗效。研究表明rhEPO对脑、脊髓在缺血后再灌注及低氧环境中神经的保护及损伤后修复等研究逐渐引起了人们的兴趣。而rhEPO是否对重型颅脑损伤有神经保护作用,无深入研究及报道。本研究拟采用Feeney氏法制备重型颅脑损伤模型来评价rhEPO的神经保护作用。首先观察大鼠重型颅脑损伤后EPO及EPOR的变化规律,寻找外源性rhEPO治疗颅脑创伤的理论依据。然后给予外源性rhEPO治疗,观察rhEPO对大鼠重型颅脑损伤后神经功能及脑水肿的改善和凋亡相关蛋白表达的影响,从行为学,形态学和分子生物学等多方面探讨EPO脑保护作用的机制,为进一步研究EPO在颅脑创伤中的神经保护作用寻找理论依据。一、促红细胞生成素及其受体在脑外伤后的表达及意义目的观察促红细胞生成素及受体在急性重型脑外伤后大脑皮质内的动态表达规律,并探讨其意义。方法采用改良的Feeney氏法建立脑外伤模型,采用RT-PCR、western blot及免疫荧光法检测促红细胞生成素（erythropoietin ,EPO）及受体（erythropoietin receptor,EPOR）的mRNA及蛋白的动态表达。结果EPO在伤后12 h表达升高,至3 d达高峰,5 d降至正常水平。而EPOR在伤后12 h表达升高,至24 h达高峰,3 d、5 d和7 d仍维持在高表达水平,未见减弱。结论大鼠急性重型颅脑损伤后大脑皮质内EPO短暂升高,而EPOR持续高表达且呈时间依赖性,提示颅脑损伤后外源性EPO能与持续高表达的EPOR结合产生神经保护作用。二、rhEPO促进颅脑创伤大鼠神经功能障碍改善的实验研究目的探讨促红细胞生成素对大鼠重型颅脑损伤后神经功能及脑含水量的影响,旨在研究其对重型颅脑损伤是否有神经保护作用。方法将78只Wistar大鼠随机分为3组:rhEPO治疗组,脑损伤组,假手术组。72只采用改良的Feeney氏法制作重型脑损伤模型。rhEPO组大鼠致伤后即刻及每天腹腔内注rhEPO（5000IU/kg）,外伤组给予等量生理盐水。假手术组只行开颅手术操作,余步骤同前;假手术组经腹腔注射等量的生理盐水。在伤后5 h、12 h、24 h、3 d、5 d、7 d六个时间点断头取脑。采用NSS神经功能评分法,评定大鼠神经功能恢复情况;采用干湿重法测量脑含水量,根据公式脑含水量=（湿重一干重）/湿重x 100%,算出脑含水量。HE及NISS染色观察损伤周边区病理改变及神经细胞坏死情况。结果损伤组NSS评分为1 d: 15.17±2.15; 3 d: 16.01±1.54; 7 d: 12.69±1.60;rhEPO组为1 d: 14.28±1.56; 3 d: 12.42±1.37; 7 d: 6.29±1.25。rhEP治疗组与损伤组有显著性差异（P<0.05）。假手术组未见神经功能受损。重型颅脑损伤后3 d损伤组脑含水量为85.58±0.36,rhEPO组为79.57±0.67。rhEPO组与损伤组相比脑水肿有显著性差异（P<0.05）。H E染色:脑损伤组伤后5 h损伤灶中心区大量神经元消失,出现较多的红细胞,伴轻度细胞水肿;伤后24 h出现明显的坏死,病灶中心区神经细胞脱失更明显,范围较5 h增大,神经细胞水肿,炎性细胞浸润;伤后7 d见胶质细胞增生。rhEPO组与损伤组比较,坏死区缩小,神经元受损及脑水肿减轻。胶质细胞增生减轻。结论rhEPO能明显改善大鼠重型颅脑损伤后神经功能症状,减轻损伤周边区脑水肿;初步证实了rhEPO对重型颅脑损伤后脑损伤有明显的神经保护作用。三、促红细胞生成素对大鼠重型颅脑损伤后神经细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响目的通过观察rhEPO对大鼠重型颅脑损伤后神经细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响,探讨rhEPO是否能有效地抑制继发性颅脑损伤,抑制神经元的凋亡。方法实验动物分组、模型制备及用药同第二部分。RT-PCR,Western blot免疫荧光法检测Bcl-2、Bax基因及蛋白表达情况。细胞凋亡原位末端标记（TUNEL）法观察神经元凋亡情况。结果①脑损伤组Bc1-2mRNA在外伤后5 h弱表达,12 h表达增强,24 h达高峰,3 d降至基础水平;rhEPO组Bc1-2 mRNA在12 h达高峰,24 h、3 d持续高表达;5 d、7 d表达下调但仍高于对照组（P<0.05）。②Bcl-2蛋白主要分布在胞浆/胞膜内,在外伤组24 h表达增加,3 d恢复到基础水平;rhEPO组Bc1-2蛋白在24 h达高峰,3 d, 5 d,7 d持续高表达（P<0.05）。③Bax表达:脑损伤组在伤后12 h可见Bax蛋白表达,伤后24小时增加缓慢;伤后72 h其数量显著增加,持续高表达一周,而rhEPO治疗组在伤后12 h,24 h和72 h的Bax蛋白表达量与外伤组相比均显著降低（P<0.05）。假手术组未见明显bax表达。④Tunel染色:Tunel染色阳性细胞于外伤后5 h即已出现,3 d达高峰,7 d仍有表达;损伤组3 d和7d凋亡细胞数分别为68±7.51和64±5.75;rhEPO组凋亡细胞数分别为32±5.48士106和29±6.51与脑损伤组相比均有显著性差异（P<0.05）。假手术组未见细胞坏死和细胞凋亡。结论rhEPO能明显减少重型颅脑损伤后不同时间点的神经细胞凋亡,上调抗凋亡蛋白Bcl-2和下调促凋亡蛋白bax表达,对大鼠重型颅脑损伤有明显神经保护作用。