牛乳中硫氰酸钠含量检测 ——高效液相色谱法与毛细管电泳法的建立

论文摘要

硫氰酸盐存在于各类天然食品（包括乳制品）中,并可在人类肝脏中合成,是氰化物解毒的代谢产物。硫氰酸盐适量添加于牛乳中,可以起到抑菌,保鲜,延长保质期的作用。但其毒理研究结果显示,过量摄入硫氰酸盐,可引发急性中毒反应,超过限量摄取也可妨碍机体对碘的利用,引起甲状腺疾病,尤其对胎儿和婴儿的智力和神经系统发育存在较大的副作用。目前,国内外对牛奶中的硫氰酸盐的检测主要利用分光光度计、离子色谱-电导检测器、离子色谱-二极管阵列检测器、离子色谱-质谱检测器等仪器进行检测。但是,国内尚未制定检测牛奶中硫氰酸钠含量的标准方法,因此也未制定出相关的生鲜乳中硫氰酸钠的限值,并难以进行乳中硫氰酸盐对人类健康潜在危害的风险评估。本文旨在建立高效液相色谱法检测乳中的硫氰酸盐含量,以求能够快速、准确、简便地测定乳品中的硫氰酸盐含量,一方面丰富检测的手段,另一方面为制定生鲜乳中硫氰酸钠的卫生标准提供依据。本实验分别采用高效液相色谱法和毛细管电泳法对原奶和市售巴氏成品乳中硫氰酸钠含量的检测方法进行了研究。根据反相离子对色谱法的原理,建立了检测牛奶中硫氰酸钠质量浓度的高效液相色谱方法。前处理使用乙腈沉淀蛋白,碱性氧化铝SPE柱除去部分水溶性维生素、氨基酸,离心脱脂得到样品。以磷酸三乙胺（pH=7.0）：甲醇=95：5作为流动相,用Agela-ASB@C18反相色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）,柱温30℃±2℃,流速0.8mL/min,以二极管阵列紫外检测器分析样品。该分析方法质量浓度范围在5-500mg/L内线性较好,r>0.9995。该方法可适用于生鲜乳和巴氏灭菌成品乳,检测限可达到0.1mg/kg,定量范围0.5～50mg/kg,精确度<10%,回收率>90%。利用毛细管区带电泳法直接检测牛奶中硫氰酸钠质量浓度。前处理与高效液相色谱法相同。在NaH2PO4-Na284O7缓冲液中加入溴化十四烷基三甲基溴化铵（TTAB）作为电渗流反相作用剂,分离电压-20kV,分离温度30℃,电极反向,以二极管阵列紫外检测器218nm波长下分析样品,质量浓度范围在5～500mg/L内线性较好,r>0.9995。该方法可适用于生鲜乳和巴氏灭菌成品乳,检测限可达到0.05mg/kg,定量范围0.5-50mg/kg,精确度<10%,回收率>90%。对高效液相色谱法和毛细管电泳法检测牛奶中的硫氰酸钠含量进行比较,毛细管电泳法的最低检测限为0.05mg/kg,低于高效液相色谱法的最低检测限0.1mg/kg,因此毛细管电泳法在检测灵敏度方面也比高效液相色谱高；高效液相色谱法在97.6～98.3%之间,毛细管电泳回收率在97.8～99.6%之间,但是高效液相色谱法的重复回收率测定标准偏差均值为0.5%低于毛细管电泳法的标准偏差均值1.2%,因此高效液相色谱法具有更高的稳定性；毛细管电泳法的理论塔板数9685高于液相色谱法的理论塔板数7623,因此其分离效果更好；毛细管电泳法的单个样品分析时间为6分钟,高效液相色谱法为15分钟,因此毛细管色谱法的分析时间更短。综上所述,两种方法所得含量检测结果和添加回收实验结果一致,检测含量范围也一致,两种方法都具有较高的准确性、精密性和稳定性。同时,也将两种新方法和文献报道中原有的紫外分光光度法和离子色谱法进行了比较,毛细管电泳的检测灵敏度最高为0.05mg/kg,低于离子色谱法的最低检测限0.08mg/kg,也低于高效液相色谱法的最低检测限0.10mg/kg和紫外分光光度法的最低检测限2mg/kg;离子色谱法回收率在98.0～106.4%之间,高效液相色谱法在97.6～98.3%之间,毛细管电泳回收率在97.8～99.6%之间,紫外分光光度法在82.57～87.71%,离子色谱法的回收率较高,但是高效液相色谱法的回收率测定结果离散程度最小,因此高效液相色谱法具有更高的准确性；高效液相色谱法的稳定性最好,日内相对标准偏差为0.65%,低于毛细管电泳法的1.45%,也低于离子色谱法的0.80%和紫外分光光度法的2.0%。综上所述,本文建立的两种新方法在准确性、精密性和稳定性都较原有方法有所提高,有利于更准确的检测牛奶中硫氰酸钠含量。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 牛奶中硫氰酸钠的作用及其毒性
• 1.1 牛乳中添加硫氰酸钠保鲜的作用机理
• 1.2 国内外应用硫氰酸钠保鲜牛乳的概况
• 1.3 硫氰酸钠在原料乳和人体中的正常生理浓度
• 1.4 硫氰酸钠的性质与毒性作用
• 1.5 原料乳中硫氰酸钠的来源
• 1.6 硫氰酸钠对人类健康的影响
• 第二章 高效液相色谱法和毛细管电泳法研究进展
• 2.1 色谱分离的基本理论
• 2.2 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理
• 2.2.1 液-液分配色谱法分离原理
• 2.2.2 液-固吸附色谱法分离原理
• 2.2.3 离子交换色谱法分离原理
• 2.2.4 离子对色谱法分离原理
• 2.2.5 空间排阻色谱法分离原理
• 2.2.6 离子色谱法分离原理
• 2.3 毛细管电泳法的基本理论及其原理
• 2.4 高效液相色谱法和毛细管电泳法常用检测器种类及其特点
• 2.4.1 紫外光度检测器
• 2.4.2 荧光检测器
• 2.4.3 差示折光检测器
• 2.4.4 电导检测器
• 2.5 国内外硫氰酸钠的检测方法的研究现状和展望
• 2.5.1 显色分光光度法检测牛奶中硫氰酸钠含量
• 2.5.2 离子色谱法检测牛奶中硫氰酸钠含量
• 2.5.3 高效液相色谱法检测牛奶中硫氰酸钠含量
• 2.5.4 毛细管电泳法检测牛奶中硫氰酸钠含量
• 2.6 影响高效液相色谱法和毛细管电泳方法建立的因素
• 2.7 方法学验证注意事项
• 2.8 总结
• 第二篇 试验研究
• 第三章 牛奶中硫氰酸钠检测方法——高效液相色谱法的建立
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 主要仪器与设备
• 3.1.1.2 试剂与药品
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 磷酸盐缓冲液与流动相溶液的制备
• 3.1.2.2 标准贮备液和工作曲线溶液的制备
• 3.1.2.3 高效液相色谱条件
• 3.1.2.4 样品前处理条件
• 3.1.2.5 标准曲线的测定
• 3.1.2.6 系统适应性参数、检出限和定量限测定
• 3.1.2.7 回收率的测定
• 3.1.2.8 稳定性测定
• 3.1.2.9 不同流动相的比较
• 3.1.2.10 不同提取液和提取方式的比较
• 3.1.2.11 不同固相萃取柱净化效果的比较
• 3.2 结果
• 3.2.0 紫外检测波长测定结果
• 3.2.1 色谱系统适应性、检测限和定量限测定结果
• 3.2.2 标准工作曲线测定结果
• 3.2.3 回收率实验测定结果
• 3.2.4 稳定性实验测定结果
• 3.2.5 不同流动相的比较结果
• 3.2.6 提取液和提取方式的比较结果
• 3.2.7 不同填料固相萃取小柱的比较结果
• 3.3 讨论
• 3.3.1 流动相的选择
• 3.3.2 提取液和提取方式的选择
• 3.3.3 前处理净化方法的选择
• 3.3.4 高效液相色谱法与紫外分光光度法的比较
• 3.3.5 高效液相色谱法检测实际样品中的硫氰酸钠含量的情况
• 3.4 结论
• 第四章 牛奶中硫氰酸钠检测方法——毛细管电泳法的建立
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 主要仪器与设备
• 4.1.1.2 试剂与样品
• 4.1.2 方法
• 2PO₄-Na₂B₄O₇缓冲液制备方法'>4.1.2.1 NaH₂PO₄-Na₂B₄O₇缓冲液制备方法
• 4.1.2.2 标准贮备液和工作曲线溶液制备方法
• 4.1.2.3 毛细管电泳仪器方法
• 4.1.2.4 前处理方法条件方法
• 4.1.2.5 标准曲线的测定
• 4.1.2.6 系统适应性参数、检出限和定量限测定
• 4.1.2.7 回收率的测定
• 4.1.2.8 稳定性测定
• 4.1.2.9 不同缓冲盐的比较
• 4.1.2.10 不同缓冲盐浓度的比较
• 4.1.2.11 不同缓冲盐pH的比较
• 4.1.2.12 净化柱对检测结果旳影响
• 4.1.2.13 毛细管电泳方法与高效液相色谱法的比较
• 4.2 结果
• 4.2.1 紫外检测波长测定结果
• 4.2.2 方法的系统适应性结果
• 4.2.3 标准工作曲线测定结果
• 4.2.4 回收率测定结果
• 4.2.5 稳定性实验测定结果
• 4.2.6 不同缓冲盐实验结果
• 4.2.7 不同缓冲盐浓度实验结果
• 4.2.8 缓冲液pH实验结果
• 4.2.9 净化方法实验结果
• 4.2.10 HPLC法与CE法检测牛奶中硫氰酸钠含量比较实验结果
• 4.3 讨论
• 4.3.1 缓冲盐的选择
• 4.3.2 净化方法的确定
• 4.3.3 高效液相色谱法、毛细管电泳法与离子色谱法的比较
• 4.4 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文情况