抗菌肽基因格拉利素的克隆及功能研究

论文摘要

人Glyrichin基因（中文：人格拉利素，又称HL52）是在本室首次发现并注册的鼠Glyrichin基因（GenBank number：AY028425，又称mL52）的基础上，以22周人胎肝cDNA文库为模板扩增出的新基因。本研究是在鼠.Glyrichin的基础上，通过生物信息学和分子细胞生物学对人Glyrichin基因进行功能研究。生物信息学分析显示人Glyrichin基因核苷酸长度为240bp，具有完整的开放阅读框架，编码79个氨基酸。电子PCR染色体定位提示人Glyrichin基因定位于染色体的20q11.22，基因组结构分析显示Glyrichin由两个外显子和一个内含子组成。蛋白序列同源性分析未发现有已知功能的同源蛋白，也未发现已知的功能域，是一个功能未知的蛋白，这对该基因功能的研究带来了一定的困难。但其理化特点如富含甘氨酸（21.5％），pI=9.58。在pH=7时带正电荷，是小分子碱性蛋白，二级结构使用DNAstar5.0软件分析为集亲水性与疏水性于一体，以β折叠为主，这与已知抗菌肽共有的结构特点相似。本研究对人Glyrichin的天然存在性进行了探讨，以Northern杂交方法分析该基因在四种人源性肿瘤细胞中的表达及转录本大小，证实了人Glyrichin具有单一转录本，大小为600bp左右：以RT-PCR分析其在胎肝、胎肾、胎脾、胎肺等四种组织中的表达情况，以GFP为标记蛋白对基因的亚细胞定位进行探索，证实了该蛋白可能分布于胞浆。生物信息学分析显示人Glyrichin理化性质具有了抗菌肽的诸多特点，我们合成了代表人Glyrichin功能的肽段pCM-19进行抗菌功能分析，证实了pCM-19良好的抗菌功能，然后利用原核表达系统，构建了含有格拉利素基因的系列缺失体的pET22b表达载体，并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达。观察到该基因诱导表达时对宿主菌菌体生长具有明显的抑制作用，初步证实了人Glyrichin具有明显的抗菌活性，同时也证实了蛋白C端对其抗菌活性的发挥是必须的。人Glyrichin完整蛋白原核表达也证实了具有良好的抗菌活性。我们选用了毕赤酵母表达系统对该基因进行功能分析，将人Glyrichin基因构建到毕赤酵母表达载体pPIC9和pPIC9K中，锂盐法转化毕赤酵母GS115中，G418抗生素筛选高拷贝转化子，进行培养诱导，对表达上清通过“纸片法”、“试管法”、“琼脂糖纸片扩散法”验证表达产物的活性。证实了人Glyrichin具有抗菌活性。通过生物信息学比较我们发现了有29个成员组成的高度同源的全新抗菌肽家系，通过代表家系九个成员的4个合成肽的抗菌活性检测和线虫源格拉利素基因原核表达分析，证实了它们具有良好的抗菌活性，强烈提示一个跨物种的抗菌肽家系的存在。综上所述，本研究获得了人源性和线虫源的格拉利素基因，确认了其天然存在性，通过原核表达和毕赤酵母表达系统证实了其具有明显的抗菌活性。生物信息学分析及实验验证提示一个跨物种的有29个成员的新的抗菌肽家系的存在。

论文目录

• 英文缩略词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 主要设备仪器
• 前言
• 第一部分: hGlyrichin基因的克隆及功能的初步确定
• 引言
• 实验设计
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 第二部分: hGlyrichin基因在毕赤酵母中的表达
• 引言
• 实验设计
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 第三部分: 格拉利素抗菌肽家系的发现及部分功能验证
• 实验设计
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表或投稿的文章
• 附录: 发表的文章