精原干细胞移植治疗因大剂量化疗所致不育的实验研究

论文摘要

随着现代医学的发展，青春期前肿瘤患者的临床治愈率显著增加，生存率显著提高，但他们中许多要长期面对因接受大剂量化疗所引起的不育问题，目前医学对这类医源性不育尚没有治疗的方法。精原干细胞具有永生化和多能化潜能，是精子形成的前体细胞，在睾丸微环境中具有增殖和分化的能力。精原干细胞移植为男性不育症的治疗开启了一扇新的大门。本实验中我们探讨精原干细胞的表面标志物及其分离纯化方法，观测精原干细胞移植后的体内迁移、增殖和分化过程，及其分化形成成熟精子的能力，为大剂量化疗所致不育的患者通过精原干细胞移植的方法来治疗提供实验依据。第一部分睾丸组织中精原干细胞的免疫化学研究目的探讨精原干细胞的表面标志物。方法对10日龄SD大鼠睾丸组织切片进行HE染色。采用免疫组织化学和免疫电镜的方法，观察α6-Integrin与c-kit在10日龄大鼠睾丸组织中的表达与分布情况。结果HE染色结果显示，10日龄大鼠睾丸组织曲细精管断面，生精上皮主要由精原细胞和Sertoli细胞组成。精原细胞体积大，细胞核大呈圆形或卵圆形，核膜明显，胞质少，细胞质聚集在细胞的一侧；Sertoli细胞核形状不规则，染色浅。以α6-Integrin作为细胞标记进行SABC法染色，见曲细精管基底室精原细胞均有阳性染色，其细胞膜和核周胞质内有α6-Integrin的阳性表达；Sertoli细胞染色阴性。对睾丸组织α6-Integrin进行免疫化学染色后，用电镜观察，发现整个曲细精管基底室精原细胞的胞质内有电子致密物沉积；Sertoli细胞的胞质内无电子致密物沉积。以c-kit作为细胞标记进行免疫荧光法染色，见曲细精管近腔侧阳性染色的精原细胞数量多，细胞膜和核周胞质有c-kit的阳性表达，而曲细精管基底膜侧精原细胞几乎无阳性染色；Sertoli细胞染色阴性。结论在睾丸组织中所有精原细胞特异性表达α6-Integrin，这其中包括未分化型与分化型精原细胞。c-kit表达于分化型精原细胞中。α6-Integrin与c-kit可作为特定时期精原细胞的表面标志，用于精原细胞的鉴定。精原干细胞膜和细胞质有α6-Integrin或c-kit阳性表达，α6-Integrin与c-kit可作为精原干细胞增殖与分化阶段的表面标志。第二部分精原干细胞的分离纯化及其鉴定目的探讨精原干细胞的分离纯化方法及纯化后的细胞特性。方法应用复合酶消化法制备10日龄SD大鼠的睾丸单细胞悬液，采用差速贴壁结合非连续性Percoll密度梯度离心的方法纯化精原细胞。分别以c-kit和α6-Integrin作为细胞标记，观察睾丸组织中的精原细胞与纯化后细胞的免疫化学特征。通过流式细胞仪分别检测纯化后细胞表达c-kit和α6-Integrin的阳性率。结果纯化后的细胞表达c-kit和α6-Integrin，与睾丸组织切片中的精原细胞一致。流式细胞仪检测：以c-kit作为细胞标记，未纯化组的阳性表达率为（1.59±0.04）％，纯化组为（68.33±2.45）％，两组差异非常显著（P＜0.01）；以α6-Integrin作为细胞标记，未纯化组的阳性表达率为（2.38±0.60）％，纯化组为（72.04±3.65）％，两组差异非常显著（P＜0.01）。台盼蓝排斥试验和PI染色表明纯化后细胞的活性率均大于95％。对纯化后的细胞原代培养3 d，观察到呈典型的链状或葡萄串状生长的精原干细胞。结论采用复合酶消化、差速贴壁结合非连续性Percoll密度梯度离心的方法纯化精原细胞，能获得纯度和活性较高的精原细胞，并能使精原干细胞相对富集。第三部分精原干细胞移植后的体内迁移、增殖和分化研究目的观测精原干细胞移植后的体内迁移、增殖和分化过程，为因化疗所致不育的患者探索一种新的治疗方法。方法以出生后6～10 d的雄性C57BL／6小鼠为供体，通过复合酶消化、差速贴壁结合非连续性Percoll密度梯度离心的方法获得待移植细胞悬液，并用PKH26-GL对待移植细胞进行荧光标记。以与供体同系生的C57BL／6雄性小鼠为受体，在出生后6周予腹腔注射白消安溶液，白消安的剂量为40 mg／Kg，可破坏内源性精原细胞，给药后4～6周采用曲细精管微注射的方法移植细胞。对移植后受体睾丸组织细胞进行荧光追踪分析，观察所移植的细胞体内迁移过程。以未接受化疗和细胞移植的正常同系生小鼠作为平行阳性对照组（1组），以单侧睾丸曲细精管微注射移植细胞作为实验组（3组），以对侧睾丸曲细精管微注射移植细胞介质作为平行阴性对照组（2组）。在3组接受移植后一月、二月、三月分别取各组睾丸组织，进行HE染色，并采用Western Blot和RFQ-PCR的方法分析各组睾丸组织表达α6-Integrin、c-kit、SCF蛋白和mRNA的差异，观测精原干细胞移植后的体内增殖和分化过程。结果PKH26荧光追踪移植细胞，在移植后一周，部分移植细胞已迁移至曲细精管基底膜。在移植后一月，曲细精管管腔内无移植细胞，移植细胞已从曲细精管管腔迁移至曲细精管基底膜，部分细胞膜上标记的荧光染料已不完整，提示移植细胞已分裂增殖。在移植后三月，移植细胞膜上标记的荧光染料呈点片状，曲细精管管腔内可见大量精子细胞形成，提示精原干细胞移植后能在同系受体睾丸内增殖分化形成精子细胞。HE染色结果显示，以白消安建立化疗致不育动物模型后，睾丸组织曲细精管内几乎所有内源性精原细胞消失，Sertoli细胞数量减少。在观察的三个月中，1组睾丸组织曲细精管内各级生精细胞依次排列，管腔内有精子形成；2组睾丸组织曲细精管内，随观测时间的延长Sertoli细胞数量有所增加，并有少量内源性精原细胞形成；3组在接受精原干细胞移植后，睾丸组织曲细精管断面各级生精细胞数量明显增加并逐渐依次排列，Sertoli细胞数量增加，曲细精管管腔内有精子形成，睾丸组织细胞内未见异常的核分裂相，睾丸组织内未见明显的炎症细胞浸润。Western Blot分析，在观测的三个月中，α6-Integrin蛋白在3组中的表达较1组低但明显高于2组，组间差异有统计学意义（均P＜0.05）。在移植后三个月中，各组α6-Integrin蛋白的表达有增加趋势，尤以1组与3组明显，各观测点间差异有统计学意义（均P＜0.01）。在观测的三个月中，c-kit蛋白在3组中的表达较1组低但明显高于2组，组间差异有统计学意义（均P＜0.05）。在移植后三个月中，各组c-kit蛋白的表达有增加趋势，尤以1组与3组明显，各观测点间差异有统计学意义（均P＜0.01）。在观测的三个月中，SCF蛋白在3组中的表达较1组低、较2组略高，3组与1组间差异有统计学意义（均P＜0.01），但3组与2组间差异无统计学意义（均P＞0.05）。在移植后三个月中，1组SCF蛋白的表达在第二月较第一月明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01），但第二月与第三月间差异不明显（P＞0.05）；2组与3组SCF蛋白的表达有增加趋势，各观测点间差异有统计学意义（均P＜0.05）。RFQ-PCR分析，在观测的三个月中，α6-Integrin mRNA在3组中的表达较1组低但明显高于2组，各组间差异有统计学意义（均P＜0.01）。在移植后三个月中，各组α6-Integrin mRNA的表达有增加趋势，尤以1组与3明显，各观测点间差异有统计学意义（均P＜0.01）。在观测的三个月中，c-kit mRNA在3组中的表达较1组低但明显高于2组，各组间差异有统计学意义（均P＜0.01）。在移植后三个月中，各组c-kit mRNA的表达有增加趋势，尤以1组与3组明显，各观测点间差异有统计学意义（均P＜0.05）。在观测的三个月中，SCF mRNA在1组中的表达较2组与3组高，差异有统计学意义（均P＜0.05）；但3组与2组间差异无统计学意义（均P＞0.05）。在移植后三个月中，各组SCF mRNA的表达有增加趋势，各观测点间差异有统计学意义（均P＜0.05）。结论精原干细胞移植后，首先从曲细精管管腔向曲细精管基底膜迁移；在移植后一月已全部迁移至曲细精管基底膜上，并开始在同系受体睾丸内增殖和分化；在移植后三月可分化形成精子细胞。白消安对曲细精管内的精原细胞毒性明显，对受体Sertoli细胞也有毒性作用，但较精原细胞对化疗药物的毒性反应轻，且能随着化疗后时间的延长有所恢复。在大剂量化疗后，生精上皮内仍存在一定数量的Sertoli细胞，这种精子发生的微环境并没有破坏，外源性精原干细胞移植后，能在受体Sertoli细胞所提供的微环境中增殖和分化。外源性精原干细胞移植后，在同系受体生精上皮内具有克隆增殖和分化的能力。这为大剂量化疗所致不育的患者，通过精原干细胞移植的方法来治疗提供了实验依据。第四部分精原干细胞移植后的生精功能研究目的观测精原干细胞移植后的生精功能，并观测冷冻保存对精原干细胞移植后增殖分化的影响，为实际应用精原干细胞移植技术奠定理论基础。方法分别以出生后10 d的雄性SD大鼠和出生后6～10 d的雄性C57BL／6小鼠为供体，通过复合酶消化、差速贴壁结合非连续性Percoll密度梯度离心的方法获得待移植细胞悬液，分别在冷冻保存前后用流式细胞仪检测细胞活性率。以雄性BALB／c裸小鼠为受体，在出生后6周予腹腔内注射白消安溶液，给药后4～6周采用曲细精管微注射的方法移植细胞。整个移植实验过程分三阶段进行。第一阶段，将未冷冻保存过的C57BL／6小鼠精原干细胞移植到BALB／c裸小鼠睾丸内（设为未冷冻保存组），分时间段用SEM观察生精过程，分析受体睾丸内α6-Integrin蛋白表达情况以及移植后三月进行IVF实验。第二阶段，将SD大鼠精原干细胞移植到BALB／c裸小鼠睾丸内，移植后三月用SEM观察精子形态。第三阶段，将冷冻保存过的C57BL／6小鼠精原干细胞移植到BALB／c裸小鼠睾丸内（设为冷冻保存组），分时间段分析受体睾丸内α6-Integrin蛋白表达情况并与未冷冻保存组进行比较。结果冷冻保存前的细胞活性率（98.39±0.59）％较冷冻保存后的细胞活性率（59.90±3.87）％明显高，差异有统计学意义（P＜0.01）。免疫组织化学染色结果显示，冷冻保存组与未冷冻保存组受体睾丸组织精原细胞膜和细胞质中都有α6-Integrin的阳性表达。在观测的三个月中，各观测点两组间α6-Integrin蛋白的表达无统计学差异（均P＞0.05）；但各组α6-Integrin蛋白的表达都有明显增加趋势，各观测点间差异有统计学意义（均P＜0.01）。SEM观察结果显示，移植后一周，精原干细胞移植后的受体睾丸组织曲细精管管腔内可见移植细胞；移植后一月，曲细精管管壁上出现较多生精细胞：移植后三月，生精细胞数量明显增加，并有大量精子细胞形成。对冷冻保存过的精原干细胞移植后三月SEM观察，曲细精管内也有大量精子细胞形成。将SD大鼠精原干细胞移植到BALB／c裸小鼠睾丸内，移植后三月SEM观察结果显示，小鼠精子发生巢内有大鼠形态特征的精子，其数量较小鼠来源的精子数量多；观察裸小鼠附睾精液，发现小鼠精液中有大鼠精子。将C57BL／6小鼠精原干细胞移植到BALB／c裸小鼠睾丸内，在移植后三月采集裸小鼠附睾精液，将其精子与雌性杂交F1代白色小鼠卵母细胞进行体外受精，得到正常发育的6枚2—细胞胚胎后移植到ICR假孕母鼠输卵管内。在移植后20 d，假孕母小鼠生出两只仔鼠，一只为黑色，另一只为浅红色。由所出生黑色仔鼠的遗传性状分析，推测其雄性配子来源于供体C57BL／6雄性小鼠，提示供体精原干细胞所生成的精子具有受精的能力。由所出生浅红色仔鼠的遗传性状分析，推测其雄性配子来源于接受移植的雄性BALB／c裸小鼠，提示在接受C57BL／6小鼠精原干细胞移植后的BALB／c裸小鼠精子发生巢内，即有供体来源的精子发生，又有受体来源的精子发生。结论精原干细胞移植后能在受体生精上皮中克隆增殖，并能分化形成成熟的精子。采用常规方式冷冻保存的精原干细胞，移植后不影响其克隆增殖和分化形成精子的能力，这对临床应用精原干细胞移植技术具有重要的实用意义。在全身大剂量化疗前，将青春期前肿瘤患者精原干细胞从睾丸组织中提取出后予以冷冻保存，在患者痊愈后将精原干细胞自体移植回患者睾丸内重启精子发生，使患者生育力长久保存。这种冷冻保存与移植技术的联合，对采用精原干细胞移植技术治疗因大剂量化疗所致的不育症，具有实际的临床应用价值。

论文目录

• 中英文名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 睾丸组织中精原干细胞的免疫化学研究
• 引言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 精原干细胞的分离纯化及其鉴定
• 引言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 精原干细胞移植后的体内迁移、增殖和分化研究
• 引言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 精原干细胞移植后的生精功能研究
• 引言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 总结
• 全文小结
• 展望
• 附录
• 综述1 精原干细胞的生物学特性及其增殖与分化的调控机制
• 综述2 精原干细胞移植及其相关研究进展
• 在读期间基金申请、发表文章、参加会议与获奖情况
• 致谢