C反应蛋白对内皮祖细胞功能的影响及其机制研究

论文摘要

第一部分人外周血内皮祖细胞的分离培养与鉴定目的:探讨人外周血来源的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）体外诱导培养和鉴定的方法,以期证实人外周血是基础研究与临床实践的一个理想的内皮祖细胞来源,并且建立一个内皮祖细胞培养与鉴定有效的技术平台。方法:密度梯度离心法获取健康成年男性外周血单个核细胞（peripheral bloodmononuclear cells,PBMNCs）,接种在人纤维连接蛋白预先包被的培养板培养,用EndoCultTM内皮祖细胞培养基诱导培养,观察内皮祖细胞集落形成单位,收集贴壁细胞,根据内皮祖细胞的特性,通过倒置荧光显微镜、流式细胞术、RT-PCR 3种方法鉴定内皮祖细胞。结果:从成人外周血分离获得的PBMNCs经体外诱导培养,可以形成内皮祖细胞的早期集落形成单位,表达内皮祖细胞的相对特异性抗原,包括AC133、CD34和VEGFR-2,并显示出具有能内吞乙酰化低密度脂蛋白（acetylate low-densitylipoprotein,acLDL）和结合荆豆凝集素（ulex europaeus agglutinin-1 lectin,UEA-1lectin）的功能,同时可表达内皮源型一氧化氮合酶基因（endothelial nitric oxidesynthase,eNOS）,所诱导培养的细胞具有内皮祖细胞的特征,鉴定为内皮祖细胞。结论:通过EndoCultTM内皮祖细胞培养基及其标准操作流程可以在人外周血中诱导培养EPCs,培养出的EPCs可表达内皮祖细胞相对特异性抗原,包括AC133、CD34利VEGFR-2及具有内皮细胞的内吞乙酰化低密度脂蛋白和结合荆豆凝集素,以及eNOS基因表达的功能。eNOS基因表达的检测或可简化EPCs的鉴定。我们的实验为EPCs的分离鉴定方法提供了借鉴。第二部分C反应蛋白对内皮祖细胞白介素8表达的影响及其机制目的:血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）是血管内皮细胞的前体细胞,不仅参与胚胎血管生成,也参与出生后的血管生发过程。C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）最初被认为只是一种炎症标志物,并不直接参与炎症反应过程,但新近的证据证实在粥样硬化性心血管疾病的发生和发展中,CRP可能参与了这一慢性炎症损伤过程。白细胞介素8（Interleukin-8,IL-8）是由内皮祖细胞分泌的一个重要的促血管新生因子。本研究旨在探讨C反应蛋白对内皮祖细胞IL-8表达的影响并探讨其可能的机制。方法:以不同浓度（5～25μg/ml）)人重组C反应蛋白及不同时间段（3～48 hours）刺激人外周血分离培养的内皮祖细胞,检测其培养液上清IL-8因子的水平和细胞IL-8mRNA的水平。抗CD16、CD32抗体和P38-MAPK信号通路抑制剂预处理内皮祖细胞后,再检测CRP对其IL-8表达水平的影响。结果:不同浓度的CRP加入到EPCs培养基中混合培养内皮祖细胞12 hours后,real-time PCR和ELISA检测IL-8的表达水平,结果显示CRP能抑制EPCs IL-8的表达,并且这一效应与CRP浓度相关,10μg/ml的CRP即可显著抑制IL-8的表达,25μg/ml浓度的CRP作用更强;P38-MAPK信号通路抑制剂SB203580及抗CD32抗体预处理可以部分阻断CRP对内皮祖细胞抑制IL-8分泌的作用;而抗CD16抗体预处理内皮祖细胞则无此作用。结论:C反应蛋白直接抑制内皮祖细胞IL-8的表达,CD32可能是内皮祖细胞表面CRP的受体之一,P38-MAPK信号传导通路可能是CRP作用于EPCs的信号转导通路之一。

论文目录

• 主要缩略词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 人外周血内皮祖细胞的分离培养与鉴定
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 C反应蛋白对内皮祖细胞白介素8表达的影响及其机制
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 论文综述 内皮祖细胞炎症与动脉硬化
• 参考文献
• 致谢