人NSCLC转移相关microRNAs筛选及功能研究

人NSCLC转移相关microRNAs筛选及功能研究

论文摘要

背景与目的肺癌是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一,世界卫生组织(WHO)2005公布数据显示肺癌死亡率为30.83/10万,男性病人的死亡率为41.343/10万,女性死亡率为19.84/10万,在所有恶性肿瘤中死亡率位居第一。由于肺癌的恶性程度较高,多数患者就诊时已出现局部侵袭和(或)远处转移,失去手术治疗的机会,放疗、化疗的毒副作用较大,而且不能够高度特异性地杀伤肿瘤细胞。因此,寻找新的早期诊断和治疗手段一直是肺癌研究的热点。肺癌的侵袭转移是一个多因素、多阶段的过程,主要取决于肺癌细胞的侵袭能力,其机制涉及到肿瘤细胞的增殖、细胞基质的降解、迁移、粘附和侵袭等方面,以及多个肿瘤抑制基因的失活和癌基因的过度表达等。尽管目前对肺癌侵袭转移发生、发展的机制已有较多的研究,但具体的分子机制尚未完全阐明。因此,寻找新的与肺癌侵袭转移相关的分子标志物和治疗靶点,研究它们在肺癌侵袭转移中的作用机制,以及与肺癌恶性分化程度、转移及预后的相关性和设计合理的治疗药物,对于提高患者的生存率具有重要的意义。MicroRNAs(miRNAs)是一类长度为22-25nt非编码的单链小分子RNA,广泛存在于真核生物中,它们能够与靶基因mRNA分子3’端非编码区(3’UTR)不完全性地互补结合,在转录后水平调控靶基因的表达,参与到胚胎的发育、细胞的分化、增殖、凋亡以及肿瘤的发生发展等过程中。近年来,越来越多的研究表明miRNAs可参与肿瘤的侵袭转移过程,已有研究报道miR-21在肺癌组织中的表达明显的高于正常肺组织的表达,报告基因分析表明miR-21能够作用于PTEN的3’UTR区降低荧光素酶的活性,通过对肿瘤抑制因子PTEN的负调控,增加了肺癌细胞的增殖和侵袭能力。He X等研究证实let-7能够通过对NIRF基因3’UTR调控而降低NIRF蛋白的表达,同时使p21(WAFl)表达水平升高,从而对肺癌细胞A549起到生长抑制的作用。因此,系统深入地研究miRNAs的异常表达和其生物学功能,对于深入研究肺癌的发生、发展、侵袭和转移具有重要的现实意义。方法(1)应用MicroRNA芯片筛查了高、低不同转移潜能人大细胞肺癌细胞株L9981/NL9980的miRNA差异表达谱;筛查了发生N2淋巴结转移的肺癌组织与没有发生转移的早期肺癌组织(T1-2NoMo)的miRNA差异表达谱;筛查了N2转移淋巴结与配对的肺癌组织的miRNA差异表达谱;(2)在肺癌细胞株L9981/NL9980中,应用real-time PCR对筛选出的差异表达miRNAs进行了验证;(3)通过基因克隆技术,成功构建了能够过表达可能与肺癌侵袭转移相关的miR-132的真核表达载体,将其转染人大细胞肺癌细胞株L9981后,应用潮霉素筛选出能够稳定过表达miR-132的稳定细胞系;(4)应用miRNA核酸锁定(Locked nucleic acid, LNA)原位杂交技术对miR-132在L9981细胞中的分布和定位进行了分析;(5)通过MTT和软琼脂克隆形成实验研究miR-132对细胞增殖的影响;通过划痕和Boyden小室实验研究miR-132对肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响;(6)通过生物信息学方法对miR-132的靶基因进行分析,构建了融合靶基因3’UTR的荧光素酶报告基因载体,通过双荧光素酶报告基因方法确定了miR-132的靶基因。(7)应用Western blot的方法研究了miR-132对靶基因蛋白的内源性调控作用,初步探讨过表达miR-132抑制肺癌L9981细胞生长的作用机制。结果(1)与NL9980细胞相比,有25个microRNA在L9981细胞中的表达水平显著下调,有21个microRNA在L9981细胞中的表达水平显著上调。(2)在不同TNM分期的肺癌组织中存在一簇差异表达的microRNAs,在肺癌组织与配对的转移N2淋巴结中也存在差异表达的microRNAs;(3)成功构建了能够过表达miR-132的真核表达载体,并建立了可过表达miR-132的L9981稳定细胞系:(4)原位杂交结果显示miR-132在肺癌细胞的细胞浆中呈颗粒状分布;(5)MiR-132对细胞增殖无明显影响,但可改变细胞的形态,降低L9981细胞的迁移和侵袭能力;(6)双荧光素酶报告基因分析表明,miR-132能够直接作用于MMP16基因的3’UTR, MiR-132过表达可抑制L9981细胞中MMP16蛋白的表达。结论(1)在高、低不同转移潜能的肺癌细胞株L9981/NL9980、不同分期的肺癌原发灶、肺癌组织与配对的转移淋巴结中筛选出了一组可能与肺癌侵袭转移相关的microRNAs; (2) miR-132在L9981细胞中主要分布于细胞浆中,稳定过表达miR-132的L9981细胞系较原代的L9981细胞系能够表达高水平的红色颗粒。miR-132对肺癌细胞的增殖无显著影响,但可改变细胞形态,可降低细胞的迁移和侵袭能力;(3)MMP16为MiR-132的靶基因,miR-132过表达可抑制L9981细胞中MMP16蛋白的表达。因此,miR-132引起L9981恶性表型改变可能是通过调控MMP16表达来实现的。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略语/符号说明
  • 前言
  • 研究现状
  • 研究目的和方法
  • 一、与NSCLC转移相关microRNAs的筛选和验证
  • 1.1 材料和方法
  • 1.1.1 材料
  • 1.1.2 实验方法
  • 1.1.3 统计学处理
  • 1.2 结果
  • 1.2.1 NL9980/L9981细胞总RNA的定量及质控
  • 1.2.2 NL9980/L9981细胞株差异表达miRNAs
  • 1.2.3 肺癌组织和转移淋巴结总RNA定量和完整性分析
  • 1.2.4 筛选肺癌细胞系和肺癌组织中共同差异表达的microRNAs
  • 1.2.5 差异表达microRNAs的real-time PCR验证
  • 1.3 讨论
  • 1.3.1 MicroRNA芯片筛选与肺癌转移相关的查差异表达miRNAs
  • 1.3.2 Real-time PCR对芯片结果的验证
  • 1.4 小结
  • 二、miR-132抑制肺癌细胞侵袭转移的功能研究
  • 2.1 材料和方法
  • 2.1.1 材料
  • 2.1.2 实验方法
  • 2.1.3 统计学处理
  • 2.2 结果
  • 2.2.1 成功构建miR-132真核表达载体
  • 2.2.2 建立稳定过表达miR-132的L9981细胞系
  • 2.2.3 荧光原位杂交分析miR-132在肺癌细胞中的分布
  • 2.2.4 miR-132对细胞增殖能力的作用
  • 2.2.5 miR-132对细胞迁移能力的影响
  • 2.2.6 miR-132对细胞侵袭能力的影响
  • 2.3 讨论
  • 2.3.1 稳定表达成熟miRNA细胞系的建立
  • 2.3.2 MiR-132对肺癌细胞的增殖的影响
  • 2.3.3 MiR-132对肺癌细胞L9981的迁移、侵袭能力的影响
  • 2.4 小结
  • 三、miR-132靶基因的预测分析和验证
  • 3.1 材料和方法
  • 3.1.1 材料
  • 3.1.2 实验方法
  • 3.1.3 统计学处理
  • 3.2 结果
  • 3.2.1 生物信息学预测miR-132的靶基因
  • 3.2.2 成功构建融合MMP16基因3’UTR的pMIR重组质粒
  • 3.2.3 成功突变MMP16表达载体3’UTR上种子区靶序列
  • 3.2.4 重组pcDNA3.1(+)-miR-132在HEK293T细胞中过表达miR-132
  • 3.2.5 MiR-132抑制融合MMP-16基因3’UTR全长序列的报告基因分析
  • 3.2.6 MiR-132能够抑制内源性MMP16的表达
  • 3.3 讨论
  • 3.3.1 靶基因的生物信息学预测
  • 3.3.2 融合靶基因3’UTR荧光素报告载体构建
  • 3.3.3 报告基因分析
  • 3.3.4 MiR-132对MMP16蛋白内源性调控作用
  • 3.4 小结
  • 全文总结
  • 本研究结果如下
  • 结论
  • 参考文献
  • 发表论文和参加科研情况说明
  • 综述 microRNA与肺癌研究进展
  • 综述参考文献
  • 致谢
  • 相关论文文献

    标签:;  ;  ;  

    人NSCLC转移相关microRNAs筛选及功能研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢