大豆乳清废水中β-淀粉酶的高效提取研究

论文摘要

大豆分离蛋白生产过程会产生大量的乳清废水,其主要成分为乳清蛋白和大豆低聚糖,直接排放会造成严重环境污染和资源浪费。大豆乳清蛋白中含有丰富的p-淀粉酶,对大豆乳清废水中p-淀粉酶进行回收是大豆废水资源综合利用并解决废水排放问题的关键环节。大豆来源的β-淀粉酶具有耐热性好、作用pH范围宽等特点,在工业上有广泛的应用。本文旨在探讨大豆乳清废水中p-淀粉酶的提取和纯化关键技术,并对制得的酶的部分酶学性质进行研究,为该技术制备的p-淀粉酶的实际应用提供依据。首先,通过pH调节、离心分离等预处理得到的上清液采用超滤（UF）浓缩,考察料液pH、操作温度、跨膜压差（TMP）和膜截留分子量（MWCO）对超滤的影响。结果表明：调大豆乳清的pH到7.0,稳定2h后离心分离,得到的上清液澄清透明,酶活回收率为97%,；选用MWCO为3 kDa的UF膜,在TMP2 bar.温度25±3℃、料液pH7的操作条件下,膜通量由初始的44L/m2·h衰减至23L/m2·h,操作时间1.8 h,平均通量达到35 L/m2·h,浓缩液中p-淀粉酶的酶活力可达到101U/ml,浓缩倍数为10倍,酶活的总回收率为92%。其次,通过硫酸铵沉淀、超滤复滤浓缩及凝胶过滤层析,对第一段UF浓缩液进行进一步纯化研究。探讨了pH、硫酸铵浓度以及浓缩液中蛋白质浓度对杂蛋白去除效果的影响,以及超滤复滤浓缩倍数的确定。结果表明：硫酸铵的添加浓度为1.2mol/L、pH为4、大豆乳清废水浓缩倍数为6-8时,杂蛋白去除率为60%,效果较好；选择MWCO为30 kDa的UF膜,在TMP2 bar、温度25+3℃、料液pH7的条件下进行操作,确定复滤浓缩倍数为10倍,此时浓缩液中p-淀粉酶的酶活为674U/ml,比活力为14U/mg,UF复滤酶活回收率为92%;经过凝胶色谱进一步纯化后得到的酶的比活力为68.6U/mg,总酶活回收率为50%;SDS-PAGE分析显示,经过凝胶纯化的样品为单一的蛋白条带,说明得到纯度较高的β-淀粉酶,β-淀粉酶的分子量约为55 kDa。最后,研究了制得的p-淀粉酶的最适作用pH和温度,以及酶对pH和温度的稳定性、金属离子对酶稳定性的影响。结果表明：制得的p-淀粉酶的最适pH值为5.5,在pH5-7.5范围内稳定性较好；最适温度为70℃,在40～60℃内稳定性较好；K+、Ca2+. NH4+、Zn2+对酶活有一定的激活作用,Cu2+和Fe2+对酶活有一定的抑制作用,Na+和Mg2+对酶的活性无明显影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第1章 绪论
• 1.1 大豆乳清废水国内外综合利用研究现状
• 1.1.1 大豆乳清废水
• 1.1.2 大豆乳清国内外研究现状
• 1.2 β-淀粉酶国内外研究进展
• 1.2.1 β-淀粉酶
• 1.2.2 β-淀粉酶酶学性质
• 1.2.3 β-淀粉酶的应用
• 1.2.4 β-淀粉酶来源
• 1.2.5 β-淀粉酶的提取纯化工艺
• 1.3 超滤技术在酶制剂中的应用基础
• 1.4 本课题研究目的与意义
• 1.5 研究内容及技术路线
• 1.5.1 研究内容
• 1.5.2 技术路线
• 第2章 β-淀粉酶的超滤浓缩过程研究
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料与仪器
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 仪器与设备
• 2.2.3 超滤实验装置
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 大豆乳清废水的预处理
• 2.3.2 UF浓缩
• 2.3.3 跨膜压差的计算以及膜通量、截留率的测定
• 2.3.4 膜的清洗再生
• 2.4 分析方法
• 2.4.1 β-淀粉酶活力测定
• 2.4.2 粗蛋白质含量测定
• 2.4.3 蛋白质分子量分布
• 2.4.4 总糖含量的测定
• 2.4.5 总固形物含量测定
• 2.4.6 灰分的测定
• 2.4.7 统计学分析
• 2.5 结果与讨论
• 2.5.1 麦芽糖标准曲线
• 2.5.2 大豆乳清主要成分分析
• 2.5.3 料液预处理结果
• 2.5.4 料液pH对超滤的影响
• 2.5.5 操作温度对超滤的影响
• 2.5.6 操作压力对膜通量的影响
• 2.5.7 膜截留分子量的选择
• 2.5.8 膜的清洗再生
• 2.6 本章小结
• 第3章 β-淀粉酶的纯化过程研究
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料与仪器
• 3.2.1 主要实验材料
• 3.2.2 主要实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 硫酸铵沉淀
• 3.3.2 超滤复滤浓缩纯化
• 3.3.3 凝胶过滤色谱纯化
• 3.4 分析方法
• 3.5 结果与讨论
• 3.5.1 牛血清蛋白曲线
• 3.5.2 硫酸铵沉淀对酶活的影响
• 3.5.3 超滤复滤浓缩对酶活的影响
• 3.5.4 凝胶过滤色谱纯化β-淀粉酶
• 3.5.5 β-淀粉酶提取纯化过程结果分析
• 3.6 本章小结
• 第4章 β-淀粉酶的主要酶学性质研究
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料与仪器
• 4.2.1 主要实验材料
• 4.2.2 主要实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 最适pH
• 4.3.2 pH稳定性
• 4.3.3 最适温度
• 4.3.4 温度稳定性
• 4.3.5 金属离子对酶稳定性的影响
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 最适pH
• 4.4.2 pH稳定性
• 4.4.3 最适温度
• 4.4.4 温度稳定性
• 4.4.5 金属离子对酶稳定性的影响
• 4.4.6 与商品β-淀粉酶主要酶学性质比较
• 4.5 本章小结
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 创新点
• 5.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录