猪圆环病毒2型山东株的分离鉴定及其ORF2基因的克隆与表达

论文摘要

猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）为圆环病毒科圆、环病毒属成员,可分为PCV 1和PCV2两个血清型。PCV 1无致病性,广泛存在于猪体及猪源细胞系内;PCV2有致病性,是引起断乳猪多系统衰竭综合征（PMWS）的病原之一。PMWS是继繁殖与呼吸综合征之后出现的又一猪免疫抑制性疾病,自1991年加拿大首次报道以来,PMWS迅速在许多国家发生流行,给养猪业带来了巨大的经济损失,已引起世界各国的广泛重视,我国也有PMWS流行和病毒分离的报道。PCV2除引起PMWS,还与猪皮炎和肾病综合征（PDNS）、仔猪先天性脑震颤（CT）等相关,PCV2的感染己严重影响养猪业的发展。据临床报告及相关实验室检测,山东省也有一定量PCV2感染,并对实际生产造成了严重影响。为了进一步了解PCV2在山东省的流行、致病情况,并进一步建立对其感染的快速诊断与检疫方法,为规模化猪场PCV2的诊断、防治提供科学依据,我们开展了相关研究。1.猪圆环病毒2型山东株的分离、鉴定及其ORF2基因序列分析根据GenBank中已发表的猪圆环病毒（Porcine Circovirus,PCV）基因序列,设计一对PCV2特异性引物。对山东省部分猪场的疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS ）的8个自然病例的淋巴结、脾脏组织进行PCR检测。检测到阳性病料2份,检测阳性率为25%,说明该病在山东省已经存在。将检测阳性的病料组织研磨、离心、过滤除菌,接种到无PCV污染的PK-15细胞进行病毒分离。病毒在PK-15细胞上盲传4代后,提取病毒DNA,利用PCV2特异性引物对细胞培养物进行PCR检测,获得阳性结果,表明PCV2在无PCV污染的PK-15细胞中增殖培养成功。将PK-15细胞增殖所得的病毒样品处理,在电镜下可观察到直径约为17nm的圆形病毒样粒子。间接免疫荧光试验可观察到PCV2特异性免疫荧光。由此说明,分离出的病毒为猪圆环病毒2型,并命名为PCV2 SD01和SD02株。根据已发表的猪圆环病毒2型（PCV2） ORF2的基因序列,设计一对PCV2的ORF2基因特异性引物,以病料组织和病毒的细胞DNA为模板,对PCV2的ORF2基因进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳,出现一条大小约0. 7 kb的特异性目的条带,与预期目的片段大小相符。利用DNA凝胶快速回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收、测序,结果表明:PCV2 SD01和SD02株的ORF2基因序列均由702bp组成,通过比较发现,分离的SD01和SD02株ORF2基因同源性为99.9%,与其他PCV2毒株ORF2基因的同源性为91.9%-99.4%。2.猪圆环病毒2型山东株ORF2基因的原核表达根据基因分析,设计一对引物,从克隆的pMD-ORF2重组质粒扩增出大小为585bp的部分ORF2基因片段（ORFs）,克隆到pMD-18T载体中,之后转入表达载体pET-32a,经Sall和Xhol酶切鉴定,得到阳性重组表达质粒pET-ORFs。将重组质粒pET-ORFs转化到表达宿主菌BL21中,经终浓度为lmmol/L的IPTG诱导,成功表达了ORF2基因编码的结构蛋白。经Western-Blot检测表明,表达的重组蛋白能够被PCV2阳性血清所识别,由此说明,重组表达的PCV2部分ORF2蛋白具有良好的反应原性。猪圆环病毒2型山东株的分离鉴定、ORF2序列分析,为进一步开展猪圆环病毒病的病原学、诊断和防制研究莫定了基础,也为下一步开展的ORF2基因编码蛋白的生物活性及建立PCV2诊断试剂盒奠定了基础;猪圆环病毒2型山东株ORF2基因的原核表达的研究,对猪圆环病毒病的诊断与疫苗研究有较大的意义。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 PCV 的研究历史
• 2 PCV 的病原学
• 3 PCV2 的分子生物学特性
• 4 流行病学
• 5 临床症状
• 5.1 断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）
• 5.2 猪皮炎和肾病综合征（PDNS）
• 5.3 仔猪先天性脑展颇（CT）
• 5.4 繁殖障碍
• 6 病理变化
• 7 致病机理
• 8 诊断方法
• 8.1 电镜法
• 8.2 免疫荧光技术
• 8.3 间接免疫荧光技术（IFA）
• 8.4 免疫组织化学法（IHC）
• 8.5 原位杂交实验（ISH）
• 8.6 聚合酶链式反应（PCR）
• 8.7 聚合酶链反应-限制性片段多态性分析（PCR-RFLP）
• 8.8 酶联免疫吸附实验（ELISA）
• 8.9 竞争性酶联免疫吸附实验（C-ELISA）
• 9 防制
• 10 研究目的与意义
• 试验一 猪圆环病毒 2 型山东株的分离、鉴定 及其 ORF2 基因序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 PCV2 型特异性DNA 片段的PCR 检测结果
• 2.2 病毒分离培养结果
• 2.3 病毒的电镜观察结果
• 2.4 间接免疫荧光试验结果
• 2.5 PCV2 ORF2 基因的PCR 扩增
• 2.6 序列测定与分析结果
• 3 讨论
• 试验二 猪圆环病毒 2 型山东株 ORF2 基因的原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 ORF2 基因的PCR 扩增
• 2.2 重组质粒pMD-ORF2 的酶切及PCR 鉴定
• 2.3 ORF2 基因的序列测定与分析结果
• 2.4 重组表达质粒的构建结果
• 2.5 ORFs 表达产物的SDS-PAGE 和Western-blot 分析结果
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢