反义寡核苷酸抑制LA-N-5细胞VEGF表达及生物效应的研究

论文摘要

背景：神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体肿瘤，而新生血管的形成是实体瘤生长的关键。目前治疗肿瘤的各种药物主要是针对肿瘤细胞本身进行的，但恶性肿瘤生长的血管依赖性提示，通过抑制肿瘤新生血管的形成可以阻止肿瘤的生长。血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）是高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂因子，可作用于血管内皮细胞，促进内皮细胞增殖迁移及血管网的形成，增加血管通透性，从而成为目前抗血管治疗的重要靶向。文献报道，VEGF在人神经母细胞瘤及其细胞系中呈现高表达。ASODN技术是一种可以选择性和特异性地阻断目的基因表达的技术，是基因治疗的重要组成部分。由于它设计容易、合成简单、样式多样、具有高度的靶异性（通过碱基互补原理）、较强的局部性和针对性，因而可以设计针对VEGF基因的ASODN抑制其超量表达。目的：研究VEGF ASODN转染对神经母细胞瘤LA-N-5细胞VEGF基因mRNA表达的影响以及对瘤细胞增殖、分化的影响。方法：1．采用CY-3红色荧光标记的VEGF寡核苷酸确定LipofectamineTM2000介导下VEGF寡核苷酸的转染条件及转染效率：2．运用LipofectamineTM2000介导的VEGF ASODN和SODN转染神经母细胞瘤细胞LA-N-5，半定量RT-PCR检测各组细胞VEGF165和VEGF121mRNA转染前后不同时间的表达变化；3．MTT法测定转染后各组细胞的生长曲线及抑制率。实验分为ASODN、ASODN+ LipofectamineTM2000、SODN、SODN+LipofectamineTM2000、LipofectamineTM2000和control组共6组。结果：1．寡核苷酸：LipofectamineTM2000体积比为2.5：1时转染效率最高，可达73.94±5.62％（P＜0.05）；2．半定量RT-PCR检测结果显示在72小时VECF165和VEGF121mRNA的表达ASODN组为0.346±0.029和0.227±0.036，ASODN+LipofectamineTM2000组为0.275±0.035和0.165±0.017，ASODN组及ASODN+LipofectamineTM2000组都能显著抑制VEGFmRNA的表达，ASODN+LipofectamineTM2000组抑制作用比ASODN组更强（P＜0.05）；3．在转染后0、12、24、36、48、60、72小时用MTT法检测瘤细胞增殖情况的变化，ASODN组和ASODN+LipofectamineTM2000组能显著抑制细胞增殖，于第48小时抑制率最高，达39.92±2.74％及55.80±2.52％，且ASODN+LipofectamineTM2000组对细胞增殖的抑制作用较ASODN组更为明显（P＜0.05）。SODN组、SODN+LipofectamineTM2000组和control组比较对LA-N-5细胞增殖的影响无显著差异（P＞0.05）。结论：1．寡核苷酸与LipofectamineTM2000体积比在2.5：1时转染效率可以达到73.94％。2．VEGF SODN不能抑制VEGF mRNA的表达，也不能抑制LA-N-5细胞的增殖和分化。3．VEGF ASODN可抑制神经母细胞瘤LA-N-5细胞VEGF在mRNA水平的表达，且ASODN+LipofectamineTM2000的效果优于ASODN，抑制效果在转染后72小时最大，达到72.50％和79.38％。4．VEGF ASODN能抑制神经母细胞瘤LA-N-5细胞的增殖和分化，LipofectamineTM2000能明显增强VEGF ASODN的抑制效果。抑制效果在转染后48小时最大，达到55.80％。

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