论文摘要
第一部分:Cuff套管技术建立大鼠自体静脉移植动物模型目的:探讨利用Cuff套管技术进行大鼠颈外静脉-肾下腹主动脉的自体静脉移植,建立一种与冠脉旁路移植术后静脉桥再狭窄病理过程相似的动物模型。方法:采用雄性Wistar大鼠20只,体重350-400g,行无菌外科手术操作。显露并切取一段颈外静脉利用Cuff套管技术端端吻合移植于肾下腹主动脉,建立大鼠自体静脉移植动物模型。分别在术后第2、4周各处死5-6只大鼠切取移植静脉,取不同时期的静脉移植物进行组织病理学检查。实验中同时切取大鼠右侧颈外静脉作为自身对照。结果:正式手术实验大鼠20只,手术平均时间为60min,移植静脉冷缺血时间10-20min,热缺血时间5-10min,手术过程中:无动物死亡。手术成功17只,术后死亡3只,手术成功率85%。组织病理学检查显示术后第2、4周可见内膜不同程度增生,伴炎症细胞浸润及中层平滑肌细胞增殖。结论:本研究应用Cuff套管吻合技术成功建立大鼠自体静脉移植动物模型,手术操作简便易行,成功率高,能客观真实地反映冠脉旁路手术后移植静脉内膜增生的病理过程,是进一步研究防治血管移植后再狭窄的理想模型。第二部分:蛋白酶体抑制剂万珂（注射用硼替佐米）在大鼠自体静脉移植模型中抑制移植血管内膜增生的实验研究目的:通过建立Wistar大鼠自体静脉移植模型,探讨炎症相关因子术后在移植血管中表达的动态变化及炎性反应对血管再狭窄的相关影响;并在此基础上研究应用蛋白酶体抑制剂硼替佐米后对相关炎症介质表达及对移植血管内膜增生的抑制作用。方法:采用雄性Wistar大鼠88只,体重350-400g,麻醉后行无菌手术操作。显露并切取一段颈外静脉利用Cuff套管技术端端吻合移植于肾下腹主动脉,建立大鼠自体静脉移植动物模型。术后将大鼠随机分为两组,分别静脉给予硼替佐米（硼替佐米组）和安慰剂（安慰剂组）治疗。每组分别在术后第24、72小时各处死8只大鼠切取移植静脉,取不同时期的静脉移植物进行实时定量逆转录聚合酶链反应（real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测趋化因子（CINC-2β和MCP-1）和细胞因子（IL-1,6和TNF-α）;与此同时取术后24小时静脉移植物标本行酶联免疫吸附测定（enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA）检测趋化因子（CINC-2β和MCP-1）和细胞因子（IL-1,6和TNF-α）（8只/组）,并进行中性粒细胞趋化性试验（8只/组）。在接下的实验中,两用药组分别在术后第2、4周各处死6只大鼠,切取不同时期的静脉移植物行组织病理学检查。以上各实验均同时取大鼠右侧颈外静脉作为自身对照。结果:组织病理学检查显示,术后2-4周移植静脉新生内膜增生明显。与安慰剂组相比,术后应用硼替佐米可明显抑制各时期静脉移植物的内膜增生（P＜0.05）;对炎症相关因子的研究显示,静脉移植物中趋化因子（CINC-2β和MCP-1）和细胞因子（IL-1,6和TNF-α）的基因表达在术后24小时均显著增高（P＜0.05）,此后至72小时逐渐下降回归至基线水平（除外MCP-1）。与安慰剂组相比,术后应用硼替佐米可明显抑制CINC-2β,MCP-1,IL-6和TNF-α在静脉移植物中的基因表达（除外IL-1）（P＜0.05）;酶联免疫吸附测定显示趋化因子（CINC-2β和MCP-1）和细胞因子（IL-1,6和TNF-α）的蛋白合成在术后24小时亦相应出现显著增高（P＜0.05）。与安慰剂组相比,术后应用硼替佐米可明显抑制CINC-2β,MCP-1,IL-6和TNF-α在静脉移植物中的蛋白合成（除外IL-1）（P＜0.05）,并显著抑制静脉移植物组织匀浆对中性粒细胞的趋化活性（P＜0.05）。结论:1.旁路移植手术后,由血管损伤诱发的局部炎症反应是导致移植血管内膜增厚/再狭窄的主要原因;2.应用蛋白酶体抑制剂硼替佐米可明显抑制移植血管术后的炎性变化和内膜增生,其可成为一种新的药物用于防治旁路移植术后的血管病变。第三部分:短发夹样NF-κB特异性RNA干扰表达载体的构建及体外功能研究目的:采用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术,构建大鼠NF-κB（RelA,p65）基因特异性小分子干扰RNA（small interfering RNAs,siRNA）表达载体质粒;体外观察其转染对NF-κB基因的沉默作用,及对NF-κB信号通路激活所致细胞增殖调控的抑制作用,为进一步体内实验研究准备条件。方法:根据GenBank提供的大鼠NF-κB（p65）基因序列,通过基因BLAST,挑选长为21个碱基的特异性寡核苷酸序列,合成其短发夹状RNA（short hairpinRNAs,shRNA）双链。通过DNA重组技术,将p65 siRNA双链与U6启动子指导的线性化真核表达载体pGenesil-1.2连接,构建p65 siRNA的重组表达载体质粒并命名为pGenesil-1.2-p65siRNA。以重组质粒转化大肠杆菌,用碱裂解法少量制备质粒DNA,进行酶切及DNA测序鉴定,用QIAGEN试剂盒大量制备质粒DNA。取重组质粒以脂质体Lipofectamine2000介导转染体外SVAREC细胞。进一步试验采用内毒素LPS（1μg/ml）刺激SVAREC细胞以激活NF-κB信号通路,Western blot检测细胞内NF-κB p65亚单位蛋白水平,流式细胞仪结合MTT检测以观察不同条件下细胞中NF-κB的活化与细胞增殖的关系及转染质粒pGenesil-1.2-p65siRNA后对NF-κB信号通路激活所致细胞增殖的干扰抑制效力。结果:成功构建大鼠NF-κB p65基因的siRNA表达质粒载体pGenesil-1.2-p65siRNA,经测序鉴定证实插入序列正确无误;体外实验,Western blot检测显示,转染质粒pGenesil-1.2-p65siRNA能显著抑制LPS刺激后SVAREC细胞内NF-κBp65蛋白的增高（P＜0.05）;流式细胞仪结合MTT检测结果显示,LPS刺激激活NF-κB信号通路可促使细胞由G0/G1期向S期转换,进而促进内皮细胞的增殖,而转染质粒pGenesil-1.2-p65siRNA可显著抑制LPS刺激后引起的内皮细胞S期细胞比例和增殖指数的增高（P＜0.05）。结论:1.成功构建大鼠NF-κB p65基因的siRNA表达质粒pGenesil-1.2-p65siRNA;2.质粒pGenesil-1.2-p65siRNA转染大鼠内皮细胞后可有效抑制相应基因及蛋白的表达合成,并显著抑制NF-κB信号通路激活引起的细胞增殖性改变,为进一步体内试验准备了条件。
论文目录
相关论文文献
标签：旁路移植术论文; 静脉移植物论文; 内膜增生论文; 再狭窄论文; 疾病模型论文; 蛋白酶体抑制剂论文; 干扰论文; 小干扰论文; 质粒载体论文; 转染论文;