猪圆环病毒2型衣壳蛋白病毒样颗粒的制备及其免疫原性的研究

论文摘要

猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2, PCV2）的感染与断奶仔猪多系统衰竭综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS）的发生密切相关。PMWS主要发生在5～18周龄仔猪,患病猪主要临床表现为生长缓慢、体重减轻、呼吸困难、黄疸、腹泻、皮炎、淋巴结肿大和病毒血症,致死率在1%～10%之间。PCV2感染呈世界性分布,已成为危害养猪业健康发展的重要病因之一。国内外相继注册了包括灭活疫苗、嵌合疫苗和亚单位疫苗,在预防PCV2感染中发挥了重要作用。由于抗原制备成本居高不下,导致市场供应的各种疫苗单头份价格在8～48元人民币之间,高昂的疫苗价格严重制约了PCV2疫苗的推广使用。根据PCV2 ORF2基因编码的主要免疫原性蛋白Cap具有在体外自我组装成病毒样颗粒（Virus-like particles, VLPs）的特点,结合SUMO蛋白表达技术,我们首次利用E.coli表达的重组蛋白在体外制备Cap蛋白VLPs,为研制PCV2 VLPs疫苗奠定了基础。1.将PCV2 ORF2编码完整Cap蛋白基因克隆到带有小泛素样蛋白（SUMO）和多聚组氨酸（6×His）的原核表达载体pSK中,转化克隆菌株JM109感受态细胞,将鉴定为阳性的重组质粒命名为p-SMK-Cap。将p-SMK-Cap转化到表达感受态细胞BL21-Condon plus （DE3）中表达重组蛋白。利用SDS-PAGE电泳可观察到部分重组蛋白以水溶性形式表达,亲和层析纯化目的蛋白以单一特异性条带出现,大小约为43 kDa,免疫印记试验和ELISA试验均证实重组表达的Cap蛋白具有良好的反应原性,命名为His-SUMO-Cap。2.利用SUMO蛋白酶切除重组蛋白His-SUMO-Cap上的SUMO标签,亲和层析纯化后获得不带有任何氨基酸残基的“天然Cap蛋白（nCap）”,大小为23 kDa。利用透射电镜观察nCap蛋白能够自我组装形成直径17nm大小的VLPs,形态结构类似与亲本PCV2 Cap蛋白,它能够和PCV2血清抗体反应并形成抗原抗体复合物,说明E.coli表达的重组蛋白能够形成正确病毒衣壳结构。3.将His-SUMO-Cap、nCap和InvCap疫苗分别免疫小鼠。利用间接ELISA可检测到Cap蛋白特异性抗体。检测发现,外周血中的细胞因子IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ表达量有所上调,利用流式细胞仪检测三种Cap抗原免疫小鼠后21天和28天时外周血T淋巴细胞亚群的变化的结果表明,空白组CD3+T淋巴细胞总数与抗原免疫组之间统计学差异显著（P<0.05）,而不同抗原之间的CD3+T淋巴细胞总数、CD3+/CD4+和CD3+/CD8+淋巴细胞总数和百分率差异不显著。4.利用纳米粒度仪检测制备的PCV2 nCap VLPs大小,然后以其作为抗原接种猪,以InvCap疫苗作为免疫对照。PCV2 nCap VLPs抗原免疫猪后产生的抗体消长规律同InvCap疫苗基本一致,免疫后的猪在7天后发生抗体阳转,直到免疫后28天,抗体仍然表现为上升趋势。淋巴细胞增殖试验和流式细胞仪的检测结果表明,不同类型的Cap抗原可以刺激机体的Th1和Th2型细胞免疫反应,IL-4和IL-10和IFN-γ在外周血中的含量明显高于未免疫猪。以上研究结果证明体外制备的PCV2 Cap VLPs疫苗有确实的刺激机体体液免疫和细胞免疫反应的能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 PCV2 的分类地位和致病性
• 1.2.2 PCV2 基因组结构和生物学特性
• 1.2.3 PCV2 感染和致病的分子机制
• 1.2.4 PCV2 疫苗研究进展
• 1.2.5 病毒样颗粒疫苗研究进展
• 1.2.6 SUMO 研究进展
• 1.3 研究目的和意义
• 第二章 PCV2 Cap 蛋白的可溶性表达和鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 PCV2 毒株、菌种、表达载体、抗体
• 2.1.2 主要生物学试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 表达引物设计和ORF2 基因扩增
• 2.1.5 重组表达载体的构建
• 2.1.6 重组Cap 蛋白的表达和鉴定
• 2.2 结果
• 2.2.1 ORF2 基因克隆和重组质粒 p-SMK-Cap 在 JM109 中的 PCR 鉴定
• 2.2.2 重组融合Cap 的表达、可溶性鉴定和反应原性鉴定
• 2.3 讨论
• 第三章 Cap 蛋白 VLPs 的体外制备和免疫学性质研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 细胞、试验动物、对照血清、PCV2 商品化亚单位疫苗
• 3.1.2 主要生物学试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.1.4 Cap 蛋白VLPs 的制备
• 3.1.5 Cap 蛋白VLPs 的鉴定
• 3.1.6 nCap 抗原小鼠免疫试验
• 3.2 结果
• 3.2.1 利用E.coli 表达的水溶性Cap 蛋白制备VLPs 的鉴定结果
• 3.2.2 PCV2 Cap 特异性抗体水平的动态变化
• 3.2.3 Cap 抗原免疫小鼠后外周血中 4 种细胞因子检测结果
• 3.2.4 CapVLPs抗原与相关抗原免疫小鼠后外周血淋巴细胞亚群比较结果
• 3.3 讨论
• 第四章 PCV2 Cap 蛋白 VLPs 对猪的免疫效果研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验动物、免疫用抗原
• 4.1.2 主要生物学试剂
• 4.1.3 主要仪器设备
• 4.1.4 Cap 蛋白VLPs 的制备
• 4.1.5 Cap 蛋白VLPs 的鉴定
• 4.1.6 nCap 抗原对猪的免疫原性研究
• 4.2 结果
• 4.2.1 利用纳米粒度仪鉴定Cap 蛋白VLPs 的大小
• 4.2.2 Cap 抗原特异性抗体的消长
• 4.2.3 Cap 抗原免疫猪 IL-4、IL-10 和 IFN-γ 等细胞因子的调控特点
• 4.2.4 Cap 抗原免疫猪 T 淋巴细胞亚群的比较
• 4.3 讨论
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历