超临界CO2诱变选育脂肪酶菌种

论文摘要

物理诱变剂和化学诱变剂可以快速、有效地诱导突变,因此在微生物育种领域得到广泛应用。通常化学诱变剂诱变效果较好,但它们大多剧毒,甚至致癌;有些物理诱变剂虽然也有较理想的诱变能力,但价格昂贵,使用时对环境也存在一定的辐射危害。超临界CO2是一种环境友好的溶剂,对微生物具有一定的致死效应。本论文首次尝试以超临界CO2为诱变剂对脂肪酶产生菌进行诱变处理,希望获得正突变株,以此验证超临界CO2诱变方法的可行性。首先,从含油土壤中筛选获得一株细菌,发酵24 h产酶活力为16.4u/mL。用全自动微生物鉴定仪快速检测该菌的各项生理生化指标,确定其为黄杆菌,暂命名为Flavobacterium sp.strain YY25。然后,用超临界CO2对YY25菌株进行诱变处理。主要考察了CO2压力、温度和处理时间,以及化学添加剂（二甲亚砜、水合肼）对YY25菌株存活率和正突变率的影响,确定最适诱变剂量,分别是8 MPa、35℃、30 min的超临界CO2和1%的二甲亚砜、0.5%的水合肼。经过诱变、筛选获得一株产酶活力为29.0 u/mL的突变株（YY25-H0.5）,比出发菌株YY25提高76.7%。最后,通过单因素实验、Plackett-Burman实验和响应面实验对YY25-H0.5进行发酵条件优化,产酶活力最高达到38.9 u/mL,是优化前的1.34倍。实验证实,超临界CO2可作为一种新的环境友好的诱变剂使用。这一研究为遗传育种提供了新的诱变方法,同时也开拓了超临界CO2应用的新领域。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 文献综述
• 2研究进展'>1.1 超临界CO₂研究进展
• 2简介'>1.1.1 超临界CO₂简介
• 2的性质和对微生物的作用'>1.1.2 CO₂的性质和对微生物的作用
• 2对微生物的致死效应'>1.1.3 高压或超临界CO₂对微生物的致死效应
• 1.1.3.1 压力、温度和处理时间的影响
• 1.1.3.2 添加剂的影响
• 1.1.3.3 致死机理的推断
• 2对酶催化的影响'>1.1.4 超临界CO₂对酶催化的影响
• 2对发酵的影响'>1.1.5 超临界CO₂对发酵的影响
• 1.2 微生物诱变研究进展
• 1.2.1 物理诱变
• 1.2.2 化学诱变
• 1.2.3 生物诱变
• 1.2.4 新型物理诱变
• 1.2.5 诱变剂及诱变剂量
• 1.3 研究目的
• 1.4 研究内容
• 1.5 选育路线
• 第二章 产脂肪酶细菌的筛选、鉴定和酶学性质研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 试剂
• 2.1.1.2 主要仪器
• 2.1.1.3 培养基
• 2.1.1.4 主要溶液
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 脂肪酶菌种筛选
• 2.1.2.2 脂肪酶活力测定
• 2.1.2.3 菌种初步鉴定
• 2.1.2.4 酶学性质研究
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 脂肪酶菌种筛选
• 2.2.1.1 平板初筛
• 2.2.1.2 摇瓶复筛
• 2.2.1.3 生长曲线制定
• 2.2.1.4 发酵曲线制定
• 2.2.2 菌种初步鉴定
• 2.2.2.1 形态观察
• 2.2.2.2 生理生化特征测定
• 2.2.3 酶学性质研究
• 2.2.3.1 酶反应最适pH值测定
• 2.2.3.2 酶反应最适温度测定
• 2.2.3.3 酶的pH稳定性测定
• 2.2.3.4 酶的温度稳定性测定
• 2.2.3.5 酶的有机溶剂稳定性测定
• 2.3 小结
• 2处理YY25菌株的诱变效应研究'>第三章 超临界CO₂处理YY25菌株的诱变效应研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 试验菌种
• 3.1.1.2 试剂
• 3.1.1.3 主要仪器
• 3.1.1.4 培养基
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 种子液制备
• 2处理'>3.1.2.2 超临界CO₂处理
• 3.1.2.3 致死效果的表征
• 3.1.2.4 正突变率的表征
• 3.1.2.5 脂肪酶活力测定
• 3.1.2.6 突变株遗传稳定性分析
• 3.1.2.7 出发菌株与突变株的对比研究
• 3.2 结果与讨论
• 2诱变处理'>3.2.1 超临界CO₂诱变处理
• 2压力的影响'>3.2.1.1 CO₂压力的影响
• 2温度的影响'>3.2.1.2 CO₂温度的影响
• 2处理时间的影响'>3.2.1.3 超临界CO₂处理时间的影响
• 2的协同效应'>3.2.1.4 二甲亚砜和超临界CO₂的协同效应
• 2的协同效应'>3.2.1.5 水合肼和超临界CO₂的协同效应
• 3.2.1.6 突变株遗传稳定性分析
• 3.2.2 出发菌株与突变株的对比研究
• 3.2.2.1 形态比较
• 3.2.2.2 生长曲线变化
• 3.2.2.3 发酵曲线变化
• 3.2.2.4 发酵最适起始pH值变化
• 3.2.2.5 发酵最适温度变化
• 3.3 小结
• 第四章 响应面法优化突变株YY25-H0.5的发酵条件
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.1.1 试验菌种
• 4.1.1.2 试剂
• 4.1.1.3 主要仪器
• 4.1.1.4 培养基
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.2.1 发酵产酶实验
• 4.1.2.2 单因素实验
• 4.1.2.3 Plackett-Burman实验
• 4.1.2.4 响应面实验
• 4.1.2.5 脂肪酶活力测定
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 单因素实验
• 4.2.1.1 碳源实验
• 4.2.1.2 氮源实验
• 4.2.1.3 诱导剂实验
• 4.2.1.4 表面活性剂实验
• 4.2.1.5 发酵起始pH实验
• 4.2.1.6 发酵温度实验
• 4.2.2 Plackett-Burman实验
• 4.2.3 响应面实验
• 4.3 小结
• 第五章 总结与展望
• 5.1 筛选
• 5.2 诱变
• 5.3 优化
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间论文发表情况
• 攻读硕士学位期间参加会议情况