论文摘要
肝纤维化作为所有慢性肝病发展的共同病理过程,对其有效防治仍是困扰世界医学界的重大难题。肝星状细胞（HSC）的活化并大量分泌细胞外基质（ECM）是肝纤维化发病的核心环节。抑制HSC活化并清除活化型HSC可以逆转肝纤维化。新近的基础与临床研究还证实,肝纤维化时发生病理性血管生成与肝窦重构,对肝纤维化的病理进程及治疗预后有重大影响。抑制肝纤维化病理性血管生成极有可能成为防治肝纤维化的全新策略。目前临床尚无防治肝纤维化的有效化学药物。传统中医药治疗肝纤维化疗效确切,中药活性成分已成为抗肝纤维化候选药物的主要来源。本课题组前期对中药姜黄的主要活性成分姜黄素的抗肝纤维化作用与分子机理进行了大量研究,发现过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARy）是控制HSC活化的“开关”分子且姜黄素可以通过激活PPARy从而抑制HSC的活化。考虑到姜黄素具有优良的抗肿瘤血管生成的作用,我们提出姜黄素可能通过改善肝脏病理性血管生成发挥抗肝纤维化作用的科学假说。本论文首先研究了姜黄素体内对纤维化肝脏血管生成的改善作用。以腹腔注射四氯化碳的方法建立大鼠肝纤维化模型并给予姜黄素治疗。结果发现,姜黄素能够明显减轻肝组织损伤,减少胶原含量并改善肝纤维化指标。姜黄素能够显著下调纤维化肝脏中诸多血管内皮标志分子及促血管生成信号分子的表达,显示对血管生成的抑制作用。体外实验表明,姜黄素在较宽剂量范围内对大鼠肝窦内皮细胞（LSEC）的活力无显著影响且未见细胞毒作用,对LSEC的体外血管生成也无显著影响。在大鼠主动脉环实验中,姜黄素也未见明显抑制血管新生的作用。因此,姜黄素能够有效改善肝纤维化及伴随的病理性血管生成；该作用可能不是通过作用于LSEC实现的,而可能是与影响肝脏血管周细胞HSC相关。为此,本论文接下来对HSC的促血管生成行为的调控机理进行了研究。现已明确,HSC是肝脏特有的血管周细胞,能够大量分泌促血管生成因子,其中血管内皮生长因子（VEGF）是最为重要的一个,并增强侵袭运动能力从而介导肝纤维化病理性血管生成。血小板衍生生长因子（PDGF）是血管生成过程中周细胞最有力的刺激因子。本论文研究发现,PDGF通过激活细胞外信号调节激酶（ERK）和哺乳动物雷帕霉素受体（mTOR）信号通路促进HSC表达VEGF及其介导的LSEC血管生成。PDGF通过激活黏着斑激酶（FAK）/RhoA信号通路增强HSC的侵袭运动与血管生成能力。激活PPARy可以抑制PDGF-β受体（PDGF-βR）的基因与蛋白表达,进而阻断ERK、mTOR及FAK/RhoA信号通路的促血管生成效应。因此,PPARy通过对PDGF-βR的转录抑制阻抑了HSC胞内的促血管生成信号转导。PPARy可以成为调控HSC促血管生成行为的关键分子靶标。在此基础上,本论文对姜黄素影响HSC促血管生成行为的分子机理进行了研究。结果发现,姜黄素通过阻断PDGF-βR/ERK和mTOR信号通路抑制HSC表达VEGF及其介导的LSEC血管生成。姜黄素通过阻断FAK/RhoA信号途径抑制HSC的侵袭运动与血管生成能力。激活PPARy可以显著增强姜黄素的作用,而抑制或沉默PPARy则显著削弱姜黄素的作用。因此认为,姜黄素通过PPARy激活依赖性的机制阻断HSC内促血管生成信号转导通路进而抑制HSC的促血管生成行为。计算机分子对接结果显示,姜黄素及其主要体内代谢物均可以与PPARy结构的活性位点之间产生较好的结合作用,PPARy可能是姜黄素的作用靶标。本论文还对另一中药活性成分川芎嗪的体外抗肝纤维化作用及机理进行了研究。结果发现,川芎嗪对人L02肝细胞的没有明显毒性作用,但能有效抑制大鼠HSC的增殖并诱导其阻滞于细胞周期的G0/G1期,这一作用与影响cyclin D1、p21、p27及p53等细胞周期调控蛋白相关。川芎嗪还能激活HSC内的线粒体凋亡途径及caspase级联反应。机理研究表明,川芎嗪阻断ERK信号通路并导致p53的激活,从而诱导HSC发生线粒体凋亡。进一步利用高糖高胰岛素（模型1）或过氧化氢（模型2）诱导HSC活化的体外模型发现,川芎嗪通过阻断ERK信号通路抑制模型1中HSC的ECM成分的表达；通过阻断ERK和p38信号通路抑制模型2中HSC的ECM成分表达。计算机分子对接结果显示,ERK2可能是川芎嗪的作用靶标。这些结果初步揭示了川芎嗪抗肝纤维化的分子机理。本论文的研究明晰了HSC促血管生成行为的调控机理与分子靶标,有助于揭示HSC在肝纤维化病理性血管生成中所发挥的重要作用。在此基础上明确了姜黄素抑制肝纤维化病理性血管生成的分子机理。此外,本论文还利用多种体外细胞模型揭示了川芎嗪抑制HSC活化与ECM表达的分子机理。这些研究为揭示中药有效成分的抗肝纤维化科学内涵并使其成为有潜力的抗肝纤维化药物提供更为深入的理论与实验依据。
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