论文摘要
菊花[Chrysanthemum grandiflorum （Ramat.） Kitamura]是我国十大传统名花、世界四大切花之一,在园林、家庭绿化美化中占有十分重要的地位。本研究将从异色菊中克隆得到的逆境诱导基因DdICE1的正义及反义植物表达载体导入根癌农杆菌EHA105中,以目前生产应用比较广泛的切花菊品种‘神马’无菌叶片为外植体,通过农杆菌介导法进行同源遗传转化研究。对转基因后代逆境胁迫耐性（低温、干旱、高盐）进行了鉴定,同时探讨了与胁迫耐性提高有关的基因表达量变化及生理生化指标。主要研究结果如下：1.转录因子DdICE1基因转化切花菊‘神马’及转基因植株的获得成功构建了由CaMV35S驱动DdICE1基因的正义及反义植物表达载体,将携带DdICE1基因的农杆菌侵染切花菊‘神马’成功实现了DdICE1对切花菊‘神马’的同源转化,通过对潮霉素筛选后初步得到抗性植株,对植株进行PCR、半定量RT-PCR及荧光定量RT-PCR检测,结果表明DdICE1的同源转化实现了基因整合表达。共获得了10株超量表达DdICE1的转基因株系（Ti）及3株表达量比未转化植株WT低的转基因株系（TAi）。2.转基因植株后代的耐性分析对转基因植株后代逆境胁迫耐性（低温、干旱、高盐）进行了初步鉴定,同时探讨了与胁迫耐性提高有关的基因表达量变化及生理生化基础。对T0代转基因植株和对照植株（WT）进行了低温耐性分析,结果表明,在低温胁迫下,与WT植株相比,过量表达的转基因株系半致死温度明显较低,而TRNAi2株系半致死温度较高。选择半致死温度差异较大的Ti2、TAi2及WT植株进行脚芽恢复生长试验,结果显示,未转化植株（WT）存活率分别为81.7%（-6℃）,46.7%（-9℃）,Ti2植株的存活率分别为93.3%（-6℃）,70%（-9℃）,而TAi2植株存活率分别为46.7%（-6℃）,23.3%（-9℃）,说明过量表达的转基因植株（Ti2）耐低温能力有了较大的提高。从表达量变化上看,转基因株系和未转化植株叶片中ICE1基因及下游CgDREBa基因表达量均呈先升高再缓慢下降的变化趋势,但Ti2植株CgDREBa基因表达量水平始终高于WT植株且在9h时达到最高峰；而与WT植株相比,TAi2植株CgDREBa基因表达量一直处于很低的水平。另外,由ICE1基因和CgDREBa基因表达量水平变化趋势相同可以推测,ICE1基因在低温驯化条件下激活了了下游CgDREBa基因的表达,从而进一步诱导下游与耐寒相关基因的表达,从而提高了植株耐寒性。从生理变化上看,脯氨酸含量在低温处理前（0 h）转基因株系及未转化植株WT均处于较低且一致的水平,在低温胁迫下,转基因株系及WT植株中脯氨酸含量水平随时间均呈缓慢升高的状态,而Ti2株系脯氨酸含量水平及幅度均明显高于未转化植株WT及TAi2植株。转基因株系及WT植株中丙二醛含量的变化趋势相似,丙二醛含量水平也随时间均呈缓慢升高的状态且Ti2株系明显低于WT及TAi2植株。转基因株系及WT植株中SOD和POD活性变化趋势相似,但Ti2株系中SOD和POD活性水平始终高于WT及TAi2植株。表明过量表达DdICE1的转基因植株在低温胁迫下的抗过氧化能力和抗渗透胁迫能力较WT及TAi2植株有所增强。对转基因株系及WT植株进行干旱耐性分析时,结果显示,Ti2植株的存活率为88.3%,显著高于WT植株（43.3%）及TAi2植株（11.7%）,表明Ti2转基因株系的耐旱能力得到提高。从基因表达量上看,转基因株系和WT植株叶片中ICE1基因及下游CgDREBa基因表达量均呈先升高再缓慢下降的变化趋势,且Ti2植株基因表达量水平始终明显高于WT及TAi植株,由ICE1基因和CgDREBa基因表达量水平变化趋势相同可以推测,ICE1基因在胁迫条件下激活了了下游CgDREBa基因的表达,从而提高植株干旱胁迫耐性。从生理变化上看,转基因植株Ti2的SOD、POD活性和脯氨酸含量都显著高于WT及TAi植株,MDA的含量则低于WT及TAi2植株,表明过量表达DdICE1的转基因植株受到干旱胁迫后抗氧化和抗渗透胁迫能力得到提高,从而增强了转基因切花菊的耐干旱胁迫能力。对转基因株系及WT植株进行耐盐性分析时,结果显示,Ti2植株的存活率（96.7%）明显高于WT植株（61.7%）及TAi2植株（41.7%）,表明Ti2转基因株系的耐盐性得到提高。从基因表达量上看,随着NaCl溶液浓度逐渐提高,Ti2、TAi2株系和WT植株叶片中ICE1基因及下游CgDREBa基因表达量均呈先升高再缓慢下降的变化趋势,但Ti2植株基因表达量水平始终高于WT植株且在10 d时达到最高峰；而与WT植株相比,TAi2植株基因表达量变化不明显。ICE1和CgDREBa表达量水平变化趋势相同可以推测,ICE1在盐胁迫条件下激活了CgDREBa的表达,从而进一步诱导下游与耐盐相关基因的表达,提高植株耐盐性。在盐胁迫下,转基因植株Ti2的SOD、POD活性和脯氨酸含量都显著高于WT及TAi2植株,MDA的含量则低于WT及TAi2植株,表明过表达转基因植株受到盐胁迫后抗氧化和抗渗透胁迫能力得到提高,从而增强了DdICE1表达的转基因切花菊的耐盐胁迫能力。以上数据显示,转正义DdICE1基因切花菊植株的综合耐逆性均比WT及TAi2植株有所增强。