高效降解棉酚菌种的选育及棉籽饼粕生物发酵的研究

论文摘要

棉籽饼粕富含蛋白质，是很好的植物蛋白饲料资源。但因其含有对动物有毒的游离棉酚，其利用价值和使用量受到极大限制。为此，人们研究了许多脱毒方法，如有机溶剂浸提、硫酸亚铁处理、氢氧化钙处理以及微生物发酵等方法。这些方法在棉籽饼粕脱毒方面起到了重要作用，但有机溶剂浸提法存在有机溶剂残留问题，对动物有潜在的危害；硫酸亚铁处理影响饲料品质和降低采食量；氢氧化钙处理脱毒效率相对较低。微生物发酵法是一种有发展前景的方法，该法不但能脱除棉籽饼粕中的棉酚，而且还可以提高棉籽饼粕的蛋白质含量，发酵底物中存留许多酶类（微生物分泌，如纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和脂解酶）、维生素、氨基酸以及一些促生长因子，因而受到了广泛重视。本课题通过选育高效降解棉酚的菌株，优化发酵工艺参数，探讨影响发酵脱毒效果的因素，考察复合发酵脱毒效果及其影响因素等途径来研究棉籽饼粕生物发酵效果。通过醋酸棉酚无糖查氏培养基和醋酸棉酚麦芽汁培养基平板筛选和培育技术，并利用棉籽饼生物发酵的方法，选育出一株对棉酚具有较高脱毒率的菌种热带假丝酵母ZD-3（Candida tropicalis ZD-3）。热带假丝酵母ZD-3细胞呈卵圆形，大小为3～4×4～5μm，出芽繁殖。用麦芽汁液体培养该菌，菌体沉淀于管底。平板培养菌落有皱纹，可形成假菌丝。热带假丝酵母ZD-3不能在半厌氧条件下发酵棉子糖以及在好氧条件下同化利用棉子糖，因此在利用该菌进行棉籽饼发酵脱毒时，应注意可发酵糖类物质（如淀粉）的补充。在液体培养基中，热带假丝酵母ZD-3用于研究的适宜取种时间为12～18 h（对数生长期）。利用热带假丝酵母ZD-3对棉籽饼进行固体发酵脱毒，通过对底物游离棉酚含量的测定，优化其发酵工艺参数。优化试验结果表明，底物组成适宜比例为棉籽饼70％、玉米粉20％、小麦麸10％。棉籽饼发酵脱毒的最佳条件参数为：发酵时间48 h，发酵温度30℃，菌液接种量5％（v／w），底物水分含量50％，自然pH值。利用热带假丝酵母ZD-3对不同因子处理的棉籽饼底物进行生物固体发酵，然后测定发酵底物中游离棉酚（FG）、蛋白质含量等指标，探讨糖源、加热处理、尿素、硫酸亚铁、碳酸钠以及矿物质等因素对棉籽饼生物发酵脱毒效果的影响。试验结果表明，棉籽饼底物中加入不同的可发酵糖源，可显著提高脱毒效率，其中淀粉效果最好，脱毒率高达91.91％；加热处理可显著降低FG含量，有利于棉籽饼底物的发酵脱毒；但底物中添加尿素，可降低棉籽饼发酵脱毒率，不利于热带假丝酵母ZD-3发酵脱毒；底物中添加硫酸亚铁、碳酸钠和复合矿物质，可显著提高假丝酵母ZD-3对棉籽饼的发酵脱毒率，脱毒率分别高达94.70％、93.96％以及96.67％。棉籽饼底物中分别加入0、0.5％、1％、2％的乙醇胺或氯化胆碱，混合均匀，然后进行热处理试验和微生物发酵试验。试验结果表明，棉籽饼底物中加入不同比例的乙醇胺或氯化胆碱，不利于棉籽饼热处理脱毒和发酵脱毒。通过测定发酵底物FG含量、底物蛋白酶活性（中性、碱性和酸性）和底物菌量的方法研究氯化胆碱、乙醇胺、卵磷脂以及全脂大豆对发酵效果的影响。试验结果表明，①在底物热处理条件下发酵，氯化胆碱、乙醇胺、卵磷脂和全脂大豆均无促进发酵脱毒作用，除氯化胆碱外，均显著降低发酵脱毒效率；氯化胆碱、乙醇胺和卵磷脂可极显著提高中性蛋白酶活性；氯化胆碱和卵磷脂可极显著提高碱性蛋白酶活性；各处理因素均可极显著提高底物酸性蛋白酶活性；各处理因素可极显著提高底物菌体含量，其中氯化胆碱效果最好。②在底物非热处理条件下发酵，乙醇胺、卵磷脂和全脂大豆均无促进发酵脱毒作用，且显著降低发酵脱毒效率，但氯化胆碱有促进发酵脱毒的趋势；卵磷脂和全脂大豆可极显著提高中性蛋白酶活性；各处理因素可极显著提高底物碱性蛋白酶活性，极显著降低底物酸性蛋白酶活性；氯化胆碱可极显著提高底物菌量，而其它因素处理的底物菌量显著降低。③研究发现氯化胆碱对棉籽饼底物发酵脱毒和底物营养价值有重要的意义，其底物蛋白酶活性高、菌量多。在底物非热处理条件下发酵，低浓度氯化胆碱具有促进发酵脱毒的作用。利用热带假丝酵母ZD-3和黑曲霉ZD-8对棉籽饼进行单菌及复合菌种发酵，然后测定发酵底物中游离棉酚（FG）、粗纤维（CF）、粗脂肪（EE）、氨基酸含量，体外法测定饲料蛋白质氨基酸消失率，用环境扫描电镜拍摄底物发酵后的显微形态结构变化等研究复合发酵效果。试验结果表明，复合发酵可极显著地降低棉籽饼底物游离棉酚含量，脱毒率为91.64％；棉籽饼底物粗蛋白、总氨基酸、必需氨基酸含量分别提高27.83％、18.15％、19.18％；提高粗蛋白、总氨基酸及必需氨基酸体外消化率分别为20.90％、26.16％、24.47％，赖氨酸和蛋氨酸分别增加20.24％、66.29％。底物CF和EE含量显著降低。环境扫描电镜图片表明，复合发酵处理棉籽饼底物后，黑曲霉形态结构发生变化，其菌丝变细，未观察到孢子头，只见光秃秃的顶囊。酵母菌形态未发现有明显变化。试验结果表明，复合发酵效果明显优于单菌发酵棉籽饼底物的效果，不但达到棉酚脱毒的目的，而且发酵饲料营养价值显著提高。复合发酵时，热带假丝酵母ZD-3对黑曲霉ZD-8的形态变化有显著影响。利用热带假丝酵母ZD-3和黑曲霉ZD-8对不同因子处理的棉籽饼底物进行复合固体发酵，然后测定发酵底物中游离棉酚（FG）、蛋白质含量等指标探讨发酵时间、底物棉籽饼比例、碳酸钠、加热处理、硫酸亚铁以及矿物质等处理因素对棉籽饼复合发酵脱毒效果的影响。试验结果表明，复合发酵适宜时间为48h；底物适宜的组成比例为棉籽饼70％、玉米粉20％、小麦麸10％；在底物中添加0.5％～1.0％的碳酸钠可提高复合发酵脱毒率。加热处理可极显著降低FG含量，有利于棉籽饼底物的发酵脱毒；底物中添加硫酸亚铁和复合矿物质，可显著提高复合发酵脱毒率。这一结论和热带假丝酵母ZD-3发酵试验结果是一致的。

论文目录

• 主要缩写词
• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 文献综述
• 第一节 棉酚的化学特性及测定方法
• 1. 棉酚的化学特性
• 2 棉酚的测定方法
• 2.1 国标苯胺法（GB 13086-91）
• 2.2 AOCS苯胺法（Ba7-58）
• 2.3 Smith苯胺比色法
• 2.4 紫外分光光度法
• 2.5 薄层扫描法
• 2.6 高效液相色谱法（HPLC）
• 2.7 动物组织中棉酚和棉酚酮对映体含量的测定（HPLC法）
• 第二节 棉酚对动物的影响
• 1 棉酚对哺乳动物的毒性
• 1.1 棉酚对非反刍动物的影响
• 1.2 棉酚对反刍动物的影响
• 2 棉酚对哺乳动物繁殖的影响
• 2.1 棉酚对雄性动物的毒害作用
• 2.2 棉酚对雌性动物繁殖性能的毒害作用
• 3 棉酚对鱼类动物的影响
• 4 棉酚对家禽的影响
• 第三节 棉酚的脱毒方法
• 1 物理法
• 1.1 加热处理
• 1.2 溶剂浸提
• 1.3 膨化脱毒
• 2 化学法
• 4处理法'>2.1 FeSO₄处理法
• 2.2 碱处理法
• 2.3 尿素处理法
• 2.4 氧化脱酚法
• 3 生物发酵法
• 3.1 生物发酵生产工艺流程
• 3.2 棉籽饼粕生物发酵的主要技术条件
• 3.3 棉籽饼粕生物发酵应注意的问题
• 4 复合脱毒法
• 参考文献
• 第二章 高效降解棉酚菌株的筛选及其形态学、生理学特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.2.1 筛选培养基
• 1.2.2 棉籽饼发酵底物
• 1.3 菌种筛选技术路线
• 1.4 平板培养条件
• 1.5 棉籽饼底物固体发酵方法
• 1.6 分析测定
• 1.7 扫描电镜样品制备方法
• 1.8 目标菌种生理学特性试验方法
• 1.9 目标菌种生长曲线测定
• 1.10 试验数据统计方法
• 2 结果与讨论
• 2.1 菌种筛选试验
• 2.1.1 醋酸棉酚无糖查氏培养基上的筛选
• 2.1.2 醋酸棉酚麦芽汁培养基上的筛选
• 2.2 棉籽饼底物固体发酵试验
• 2.2.1 不同菌种发酵对底物FG含量和脱毒率的影响
• 2.2.2 不同菌种发酵对底物CP含量的影响
• 3 目标菌株热带假丝酵母ZD-3形态特征
• 4 目标菌株热带假丝酵母ZD-3生理学特征
• 5 热带假丝酵母ZD-3生长曲线
• 6 小结
• 参考文献
• 第三章 棉籽饼固体发酵脱毒工艺参数的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 基础底物处理
• 1.2 菌种
• 1.3 棉籽饼固体发酵工艺参数优化方法
• 1.3.1 底物组成对发酵的影响
• 1.3.2 底物水分含量对发酵的影响
• 1.3.3 接种量水平对发酵的影响
• 1.3.4 温度对发酵的影响
• 1.3.5 发酵时间对发酵的影响
• 1.4 样品处理
• 1.5 分析测定方法
• 2 结果与分析
• 2.1 底物组成的优化
• 2.2 底物含水量的优化
• 2.3 菌液接种量的优化
• 2.4 发酵温度的优化
• 2.5 发酵时间的优化
• 3 结论
• 参考文献
• 第四章 影响热带假丝酵母ZD-3对棉籽饼发酵脱毒效果的因素研究
• 第一节 不同糖源、尿素、硫酸亚铁、碳酸钠、复合矿物质以及加热处理对棉籽饼发酵脱毒效果的影响
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 棉籽饼固体发酵
• 1.2.2 分析测定
• 1.2.3 试验数据统计方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不同糖源对假丝酵母ZD-3发酵脱毒的影响
• 2.2 加热处理对棉籽饼棉酚脱毒的影响
• 2.2.1 加热处理对棉籽饼的脱毒效果
• 2.2.2 加热处理对假丝酵母ZD-3发酵脱毒效果的影响
• 2.3 尿素对棉籽饼棉酚脱毒的影响
• 2.3.1 尿素对棉籽饼加热处理脱毒效果的影响
• 2.3.2 尿素对假丝酵母ZD-3发酵脱毒的影响
• 2.4 硫酸亚铁对棉籽饼棉酚脱毒的影响
• 2.4.1 硫酸亚铁对棉籽饼加热处理脱毒效果的影响
• 2.4.2 硫酸亚铁对假丝酵母ZD-3发酵脱毒的影响
• 2.5 碳酸钠对假丝酵母ZD-3发酵脱毒的影响
• 2.5.1 碳酸钠对棉籽饼加热处理脱毒效果的影响
• 2.5.2 碳酸钠对假丝酵母ZD-3发酵脱毒的影响
• 2.6 矿物质对假丝酵母ZD-3发酵脱毒的影响
• 3 讨论
• 3.1 棉籽饼生物发酵的脱毒效果
• 3.2 棉籽饼生物发酵的蛋白质营养价值变化
• 3.3 糖源与假丝酵母ZD-3发酵脱毒的效果
• 3.4 加热处理与棉籽饼发酵脱毒效果
• 3.5 尿素与棉籽饼发酵脱毒效果
• 3.6 硫酸亚铁与棉籽饼发酵脱毒效果
• 3.7 碳酸钠与棉籽饼发酵脱毒效果
• 3.8 矿物质与棉籽饼发酵脱毒效果
• 4 小结
• 第二节 氯化胆碱和乙醇胺对棉籽饼生物发酵脱毒效果的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 棉籽饼底物热处理
• 1.2.2 棉籽饼底物酵母菌固体发酵
• 1.2.3 样品处理
• 1.2.4 分析测定
• 1.2.5 试验数据统计方法
• 2 结果与分析
• 2.1 氯化胆碱和乙醇胺对棉籽饼热处理效果的影响
• 2.1.1 氯化胆碱热处理试验结果
• 2.1.2 乙醇胺热处理试验结果
• 2.2 氯化胆碱和乙醇胺对棉籽饼发酵脱毒效果的影响
• 2.2.1 氯化胆碱发酵试验结果
• 2.2.2 乙醇胺发酵试验结果
• 3 讨论
• 3.1 氯化胆碱和乙醇胺与棉籽饼热处理效果
• 3.2 氯化胆碱和乙醇胺与棉籽饼发酵脱毒效果
• 第三节 氯化胆碱、乙醇胺、卵磷脂以及全脂大豆对发酵底物蛋白酶活性和酵母菌生长量的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 棉籽饼底物热处理
• 1.2.2 棉籽饼底物酵母菌固体发酵方法
• 1.2.3 样品处理
• 1.2.4 分析测定
• 2 结果与分析
• 2.1 对棉籽饼发酵脱毒效果的影响
• 2.1.1 氯化胆碱对棉籽饼发酵脱毒效果的影响
• 2.1.2 乙醇胺对棉籽饼发酵脱毒效果的影响
• 2.1.3 卵磷脂对棉籽饼发酵脱毒效果的影响
• 2.1.4 全脂大豆对棉籽饼发酵脱毒效果的影响
• 2.2 对棉籽饼发酵底物蛋白酶活性的影响
• 2.2.1 氯化胆碱对蛋白酶活性的影响
• 2.2.2 乙醇胺对蛋白酶活性的影响
• 2.2.3 卵磷脂和全脂大豆对蛋白酶活性的影响
• 2.2.4 不同处理因素的蛋白酶活性对比
• 2.3 对棉籽饼发酵底物菌量的影响
• 2.3.1 氯化胆碱对棉籽饼发酵底物菌量的影响
• 2.3.2 乙醇胺对棉籽饼发酵底物菌量的影响
• 2.3.3 卵磷脂对棉籽饼发酵底物菌量的影响
• 2.3.4 全脂大豆对棉籽饼发酵底物菌量的影响
• 3 讨论与小结
• 3.1 各处理因素与棉籽饼发酵脱毒效果
• 3.2 各处理因素与棉籽饼发酵底物蛋白酶活性
• 3.2.1 各处理因素对中性蛋白酶活性的影响
• 3.2.2 各处理因素对碱性蛋白酶活性的影响
• 3.2.3 各处理因素对酸性蛋白酶活性的影响
• 3.3 各处理因素与棉籽饼发酵底物菌量
• 3.4 氯化胆碱的重要作用
• 参考文献
• 第五章 棉籽饼粕复合固体发酵效果研究
• 第一节 复合固体发酵对棉籽饼脱毒及营养价值的影响研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 棉籽饼固体发酵
• 1.2.2 体外消化试验
• 1.2.3 分析测定
• 1.2.4 发酵底物形态扫描电镜拍摄
• 1.2.5 试验数据统计方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不同发酵方式对游离棉酚含量的影响
• 2.2 不同发酵方式对棉籽饼底物CP含量及其体外消化率的影响
• 2.3 不同发酵方式对棉籽饼底物CF含量的影响
• 2.4 不同发酵方式对棉籽饼底物EE含量的影响
• 2.5 不同发酵方式对棉籽饼底物氨基酸含量的影响
• 2.6 不同发酵方式对棉籽饼底物氨基酸体外消化率的影响
• 2.7 不同发酵处理的棉籽饼底物扫描电镜图
• 3 讨论
• 3.1 棉籽饼生物发酵的脱毒效果
• 3.2 棉籽饼生物发酵的营养价值变化
• 3.3 发酵底物中微生物形态结构的变化
• 4 小结
• 第二节 影响棉籽饼复合固体发酵效果的因素研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 发酵时间对复合发酵的影响
• 1.2.2 底物中棉籽饼比例对复合发酵的影响
• 1.2.3 碳酸钠对复合发酵脱毒效果的影响
• 1.2.4 加热处理对复合发酵脱毒效果的影响
• 1.2.5 硫酸亚铁对复合发酵脱毒效果的影响
• 1.2.6 矿物质对复合发酵脱毒效果的影响
• 1.3 分析测定与试验数据统计方法
• 2 结果与分析
• 2.1 发酵时间对复合发酵的影响
• 2.2 底物中棉籽饼比例对复合发酵的影响
• 2.3 碳酸钠对复合发酵脱毒效果的影响
• 2.4 加热处理对复合发酵脱毒效果的影响
• 2.5 硫酸亚铁对复合发酵脱毒效果的影响
• 2.6 矿物质对复合发酵脱毒效果的影响
• 3 讨论
• 3.1 发酵时间与棉籽饼复合发酵脱毒的效果
• 3.2 底物中棉籽饼比例与复合发酵脱毒的效果
• 3.3 碳酸钠与复合发酵脱毒的效果
• 3.4 加热处理与复合发酵脱毒的效果
• 3.5 硫酸亚铁与复合发酵脱毒效果
• 3.6 矿物质与复合发酵脱毒的效果
• 4 小结
• 参考文献
• 论文结论与创新点
• 论文结论
• 创新点
• 研究展望
• 附录一 蛋白酶活力测定
• 附录二 酵母菌数平板测定法
• 附录三 攻博期间发表的论文
• 致谢