论文摘要
乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase,GO)是一种黄素蛋白酶,它以氧作为电子受体,能催化乙醇酸至乙醛酸的氧化反应。产物乙醛酸是一种重要的化工中间体,可以广泛应用于医药、香料、农药等领域。生物法合成乙醛酸具有污染少,转化率高,产品纯度高等优点,因此是很有前途的合成乙醛酸工艺路线。目前生物法合成乙醛酸主要是利用乙醇酸氧化酶将乙醇酸氧化成乙醛酸,同时利用过氧化氢酶消除反应产生的过氧化氢,防止产物的进一步氧化。本研究目的在于通过构建基因工程菌来催化合成乙醛酸,主要内容包括GO的毕赤酵母重组菌构建、重组菌的发酵条件、重组菌催化合成乙醛酸条件。从新鲜菠菜叶中提取总RNA,利用RT-PCR技术获得编码GO基因的cDNA片断。通过基因重组将GO基因克隆到载体pAO815中,构建了胞内表达载体pAO815/GO。重组质粒以BglⅡ线性化后电转整合至甲醇营养酵母GS115染色体。胞内蛋白采用SDS-PAGE电泳分析,结果显示诱导表达蛋白的分子量约为40 kDa。甲醇诱导重组菌表达,并对诱导的条件进行优化,确定最佳的pH为6.0,最佳的表达时间为96 h,最佳混合碳源为10g/L山梨醇和0.5g/L甲醇。在最佳的培养条件下,细胞的GO酶活达到147 IU/g湿菌体。重组毕赤酵母表达了乙醇酸氧化酶,并且毕赤酵母胞内含有过氧化氢酶,所以重组毕赤酵母可以用于合成乙醛酸。采用重组毕赤酵母作催化剂,乙醇酸为原料,对乙醛酸的合成条件进行了研究,并优化获得了较佳的工艺条件。结果表明:在乙醇酸浓度为0.20 mol/L,重组酵母湿菌体为10g/L,黄素单核苷酸(FMN)浓度为0.01 mmol/L,pH 7.6,通入空气速率(?),25℃反应96 h,乙醛酸的产率达到85.0%。
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