柞蚕肠道菌群分析及产酶菌的筛选与鉴定

论文摘要

柞蚕Antherea pernyi属于鳞翅目大蚕蛾科柞蚕属，是一种经济价值很高的生物模式昆虫。分布于我国的10多个省区，以山东、辽宁、河南等华北地区为主。昆虫肠道微生物对宿主的营养、免疫具有重要作用，已有很多关于不同种类昆虫肠道菌的研究。尽管家蚕（Bombyx mori）肠道微生物群落结构得到了较多的研究，但目前对柞蚕等野蚕肠道微生物的研究还很少。由于不同肠道环境的差异，不同昆虫肠道微生物也有不同的生理差异，这种差异也提供了更多待开发的微生物资源。通过对柞蚕肠道菌群结构及产酶菌的研究，了解野生柞蚕的肠道环境，探寻具有新的生理及功能的微生物，可用于研制微生态制剂，提高柞蚕生产的叶丝转化率及抗病能力。试验采用NA、LB、萨氏培养基培养分离5龄期柞蚕幼虫的肠道细菌，最终得到12株形态、生理生化表型各异的纯化菌株，结合16S rDNA系统发育分析，对其进行鉴定。经鉴定获得的柞蚕肠道菌有芽孢杆菌、葡萄球菌、肠杆菌属，其菌群结构特征与家蚕存在相似性，其中以芽孢杆菌为主要菌群。采用筛选培养基筛选产纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶的菌株，并测定产酶菌抑菌圈的D/d值和酶活性，比较各菌株的产酶能力和酶活力。芽孢杆菌是分离得到的肠道菌中产纤维素酶、蛋白酶的主要菌群，其产纤维素酶D/d值在1.5左右，活性均在100U/ml以上；产蛋白酶D/d值在5.0左右，活性大部分在24U/ml以上；葡萄球菌产蛋白酶能力较弱，酶活力在10U/ml左右；肠杆菌不产酶；筛选得到的脂肪酶活性很低。由于蚕肠道上皮细胞不能合成纤维素酶，肠道中能利用纤维素的细菌对蚕饲料中纤维素的消化利用可能起重要作用。另外，纤维素酶在饲料、环境等工业中有重要的实际应用意义。试验纯化获得一株产纤维素酶活性较高的芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis，pH7.0、50℃条件下，其胞外酶活可达118.5U/ml。依据已解析的细菌纤维素酶基因，设计特异引物扩增了该菌株的内切葡聚糖酶（endo-β-glucannase）基因，获得其ORF全长1.5kb，编码499个氨基酸，蛋白分子量约为55Kd。将获得的酶基因连接至pET-28a（+）表达载体，转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，用IPTG进行诱导表达，经SDS-PAGE电泳和Western blotting检测，表明被诱导的目的蛋白得到了稳定的表达。与原菌株表达酶活性相比，原核表达经传代培养到第三代有最高酶活性126.8U/ml，可以达到原菌株的活力水平，为以后的真核表达及微生态制剂的研究奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 昆虫肠道微生物多样性研究进展
• 1.1.1 昆虫肠道微生物多样性
• 1.1.2 肠道菌群多样性的影响因素
• 1.1.3 昆虫肠道菌的功能
• 1.1.4 昆虫肠道产纤维素酶菌的研究
• 1.2 纤维素酶
• 1.2.1 纤维素酶的酶系组成、作用机理
• 1.2.2 动物内源性纤维素酶
• 1.2.3 微生物纤维素酶
• 1.2.4 纤维素酶的应用与前景
• 2 引言
• 2.1 研究目的及意义
• 2.2 主要研究内容
• 2.2.1 柞蚕肠道菌群结构鉴定
• 2.2.2 肠道产酶菌的筛选
• 2.2.3 纤维素酶基因的克隆与表达
• 2.3 技术路线
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.2 仪器与试剂
• 3.2.1 主要实验仪器
• 3.2.2 主要生化试剂
• 3.2.3 常用溶液的配置
• 3.2.4 试验用培养基
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 柞蚕解剖
• 3.3.2 肠道菌的培养、分离、纯化
• 3.3.3 肠道菌的生理生化检测
• 3.3.4 肠道菌 DNA 提取
• 3.3.5 细菌 16S rDNA 序列扩增、分析
• 3.3.6 产酶菌的筛选
• 3.3.7 酶活测定
• 3.3.7.1 纤维素酶活力测定
• 3.3.7.2 脂肪酶活力测定
• 3.3.7.3 蛋白酶活力测定
• 3.3.8 内切葡聚糖酶基因（endo-β-glucosidase）的原核表达
• 3.3.8.1 内切葡聚糖酶基因的扩增
• 3.3.8.2 原核表达载体的构建
• 3.3.8.3 菌液的诱导表达
• 3.3.8.4 SDS-PAGE 电泳检测
• 3.3.9 表达产物的 Western blot 分析
• 3.3.10 重组菌株表达的稳定性检测
• 4 结果
• 4.1 肠道菌群结构鉴定
• 4.1.1 菌落形态及生理生化特征
• 4.1.2 16S rDNA 序列的系统发育分析
• 4.2 产酶菌的筛选鉴定
• 4.3 酶活测定
• 4.3.1 纤维素酶活力
• 4.3.2 脂肪酶活力
• 4.3.3 蛋白酶活力
• 4.4 产纤维素酶菌的发酵条件
• 4.4.1 不同发酵时间对产纤维素酶的影响
• 4.4.2 不同 pH 对产纤维素酶的影响
• 4.4.3 不同温度对产纤维素酶的影响
• 4.5 内切葡萄糖苷酶基因序列分析
• 4.6 内切葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达
• 4.7 表达产物的 Western blot 分析
• 4.8 细胞外酶活测定
• 4.9 重组菌株表达的稳定性检测
• 5 讨论
• 5.1 柞蚕肠道菌多样性
• 5.2 肠道产酶菌
• 5.3 酶活测定
• 5.4 产纤维素酶菌的发酵条件
• 5.5 内切葡萄糖苷酶基因的原核表达
• 5.6 重组质粒稳定性检测
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介