论文摘要
S100C是具有EF手型的S100蛋白家族的成员之一。S100蛋白是一组参与细胞周期活动、细胞分化、肿瘤生长以及细胞外基质分泌活动的钙结合调节蛋白，在机体生物学活动中发挥着重要的作用。S100C的主要功能是传导钙依赖性的细胞调节信号，参与细胞的增殖、分化、凋亡和骨架的构建。最新研究表明S100C与肿瘤的发生、发展和转移关系十分密切。本课题组近期运用蛋白质组学技术发现S100C蛋白在肺癌组织中表达异常，提示该蛋白可能在肺癌的发生、发展中有着重要的作用。本研究采用半定量RT-PCR技术探讨肺癌组织S100C基因的mRNA表达水平，用PCR的方法获得S100C基因全序列，并通过设计合适的酶切位点，构建S100C原核表达载体。对筛选鉴定的阳性克隆进行诱导条件的优化，使之高效表达融合蛋白，用Ni离子亲和层析法纯化融合蛋白，通过免疫日本大耳白兔制备抗融合蛋白的多克隆抗体。为下一步大样本检测其敏感度和特异度奠定基础，为鉴定和研究其它潜在肿瘤标志物提供理论和技术支持。方法1．结合质粒载体pET30a（+）的多克隆位点，运用Primer Premier 5.0软件进行引物设计。上游引物引入BamHI酶切位点，下游引物引入XhoI酶切位点。2．以β-actin为内参，运用半定量RT-PCR技术检测26例肺癌组织和癌旁组织S100C基因mRNA的表达水平。运用PCR技术克隆S100C基因的cDNA全长片段，构建原核表达载体，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，进行阳性克隆筛选鉴定。3．设立不同诱导组对筛选出的阳性克隆进行诱导时间和IPTG诱导浓度的优化。4．用尿素法溶解包涵体，用Ni离子亲和层析法纯化融合蛋白。5．纯化后的融合蛋白与弗氏佐剂超声混合后免疫日本大耳白兔，间隔14d加强免疫1次，共免疫3次。6．用免疫琼脂双向双扩散法检测抗体效价，Western blotting检测抗体特异性。结果1．肺癌组织中S100C mRNA表达水平低于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。2．成功构建了S100C原核表达载体，序列同源性达100％。3．以终浓度为0.8mmol／L的IPTG诱导5h蛋白表达量最高。通过Ni离子亲和层析柱纯化融合蛋白，获得了纯度为94.3％的融合蛋白。4．融合蛋白免疫日本大耳白兔后，产生了高效价高特异性的多克隆抗体。结论1．High-Affinity Ni-IDA Resin亲和层析法是一种高效的纯化带有His-Tag融合蛋白的方法。2．纯化的S100C融合蛋白免疫日本大耳白兔后，可以产生抗S100C融合蛋白的抗体，而且该抗体可以与人肺鳞癌和肺腺癌组织蛋白发生反应，为下一步在肺癌组织中大样本检测该抗体的特异度奠定了基础。