柑橘黄龙病Serralysin蛋白的重组表达和纯化

论文摘要

柑橘黄龙病是世界柑橘生产中最具毁灭性的病害,目前对柑橘黄龙病的致病机理还不清楚。对治病机理的研究一般着眼于对治病基因或相关蛋白的功能分析上,分泌蛋白就是这样一类被人们所关注的分子。Ⅰ型分泌系统在细菌中行使蛋白主动运输功能,其运输机制被研究的较为清楚,通过其分泌进攻性的蛋白分子是细菌作用于寄主的一个主要途径。本研究根据GenBank上的全基因组序列,设计了引物,扩增到了柑橘黄龙病中的Ⅰ型分泌蛋白基因（COG2931）,并构建了它的重组表达载体,在大肠杆菌中进行了表达,并对表达出的蛋白进行了分离和纯化。主要获得了一下结果：1.从长春花感病叶片中提取了黄龙病病原菌的基因组DNA,并用PCR方法和电子显微镜观察的方法进行了验证。利用提取的DNA成功扩增了柑橘黄龙病中的Serralysin基因,得到的片段长度为2089bp,经测序和比对,发现该基因确实属于Serralysin家族,并在其序列中发现了3个保守结构域,和3个串联重复的区域。2.我们对该基因设计了基于pET-22b（+）的重组表达载体,使其与组氨酸标签融合表达,再转化到大肠杆菌BL21（DE3）细胞内进行了诱导表达。对诱导表达的条件进行了筛选,得到的最适表达条件为将菌液在37℃下振荡培养到OD6000.6,加入0.4mM的IPTG,然后在28℃下继续培养3.5小时。3.诱导表达得到的蛋白进行了分离和纯化,方法为硫酸沉淀和Ni柱亲和层析。最后得到的蛋白纯度为99%,蛋白的回收率为1%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1. 前言
• 1.1 柑橘黄龙病病原
• 1.2 柑橘黄龙病的诊断方法
• 1.3 柑橘黄龙病的防治
• 1.4 柑橘黄龙病的研究进展
• 1.5 Ⅰ型分泌系统
• 1.6 Ⅰ型分泌蛋白和RTX toxins,serralysin
• 1.7 柑橘黄龙病病原中的Ⅰ型分泌系统
• 1.8 蛋白质表达纯化的研究进展
• 1.9 研究目的与意义
• 2. 材料和方法
• 2.1 病原叶
• 2.2 细菌菌株和质粒
• 2.3 主要试剂和耗材
• 2.4 主要溶液的配制
• 2.5 SDS-PAGE
• 2.6 主要仪器
• 2.7 CTAB法提取植物DNA
• 2.8 大肠杆菌质粒DNA的提取
• 2.9 质粒转化大肠杆菌感受态细胞
• 2.10 PCR
• 2.11 阳性克隆的检测
• 2.12 重组质粒的表达
• 2.13 大肠杆菌细胞的破碎
• 2.14 目标蛋白可溶性分析
• 2.15 硫酸铵沉淀法对蛋白进行粗提
• 2.16 应用His标记蛋白质微量纯化套装对目标蛋白进行纯化和分离
• 2.17 考马斯亮蓝法测蛋白浓度
• 3. 结果与分析
• 3.1 黄龙病病原的检测
• like基因的克隆'>3.2 Serralysin_like基因的克隆
• 3.3 基因片段连接T载体,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞
• 3.4 测序结果
• 3.5 连接表达载体所用引物的设计和PCR扩增
• 3.6 连接表达载体pET-22b（+）
• 3.7 蛋白的诱导表达和最适表达条件的筛选
• 3.8 表达蛋白的可溶分析
• 3.9 蛋白的纯化
• 3.10 蛋白浓度的测定
• 4. 讨论
• like基因的克隆'>4.1 Serralysin_like基因的克隆
• like蛋白的结构'>4.2 Serralysin_like蛋白的结构
• 4.3 包涵体的处理
• 4.4 蛋白的纯度
• 5. 总结与展望
• 参考文献
• 致谢