不同种型布鲁氏菌进化中基因获得与缺失研究

论文摘要

布鲁氏菌病是一种人畜共患传染病,主要导致家畜流产和人类波状热,该病在全世界均有分布,在部分国家广泛流行。布鲁氏菌是布鲁氏菌病的病原体,能引起家畜和野生动物感染,人布鲁氏菌病主要是由于接触感染的动物而致病。此外,布鲁氏菌容易气溶胶化,是早期被用于生物战剂研究的细菌。因此,布鲁氏菌病是一种危害人类健康、经济发展和社会安全的重要传染病。根据宿主范围和生化特性等的不同,布鲁氏菌可分为6个经典种19个生物型,包括羊种(1、2和3型)、牛种(1、2、3、4、5、6、7和9型)、猪种(1、2、3、4和5型)、犬种、绵羊附睾种和沙林鼠种。其中牛种、羊种和猪种为世界各地的主要致病种。牛种布鲁氏菌主要感染牛,羊种布鲁氏菌主要感染绵羊和山羊,而猪种布鲁氏菌则有更为广泛的宿主范围。同时,这3个种也是引起人布鲁氏菌病的主要布鲁氏菌种。不同种的布鲁氏菌具有不同的宿主范围,对人或动物的毒力也存在很大的差异,有的动物带菌不表现症状,而有的种型症状明显。在我国主要流行的是羊种和牛种布鲁氏菌,而其它国家和地区流行的更多的是牛种,其次是羊种。布鲁氏菌是一种在DNA水平相对保守的细菌,这与该菌的基本特性有关。布鲁氏菌是一种胞内寄生菌,与其它生物发生遗传交换的几率小,从而使得其基因组的动态变化小。布鲁氏菌中有两条染色体,但没有质粒,很多外源的质粒也无法在细菌中复制,这也是其基因组变异小的一个原因。尽管如此,一系列的遗传多态性的分析显示,不同布鲁氏菌株在DNA水平上仍存在较大的差异。DNA杂交、VNTR多态性分析结果显示,不同种型的布鲁氏菌及其分离株可被分为不同的基因型,提示其基因组中存在的变异。基因组测序为细菌的研究提供了新的平台,特别是在同种细菌有多株菌完成测序的情况下,可进行全基因组序列的比较。这种基于全基因组的比较能够提供大量有关细菌基因组组成、致病性等的相关信息。自2001年完成第一株布鲁氏菌测序以后,到目前为止,数据库中已有10株布鲁氏菌的全基因组序列。多株布鲁氏菌全基因组测序的完成,为基因组的比较研究提供了可能,也为不同种型布鲁氏菌基因组比较和基因组进化分析奠定了基础。在本研究中,我们首先从数据库中下载10株布鲁氏菌的全基因组序列,对基因组的组成进行了比较分析,通过编写脚本,完成10株布鲁氏菌全基因组序列的系统比较。将每株菌的基因与其它菌的基因及其基因组进行比较,得到全部基因比较的非冗余的0/1矩阵,查找出10株菌中均存在的基因和差异分布的基因,并对这些基因在两条染色体上的分布进行了比较分析。结果显示,来自不同种型的10株布鲁氏菌无论是两条染色体的长度、编码基因的数量和tRNA,还是假基因的数量均存在一定差异。大部分菌株的I号染色体大小为2.1Mb,II号染色体大小为1.2Mb,而猪种布鲁氏菌B.suis 23445菌株的I号染色体只有1.9Mb,缺少的区域被转移到了II号染色体上。不同菌株中假基因的数量差别很大,最少的microti菌株只有63个,而2308菌株则多达316个,假基因的积累反映了菌株的适应性进化。根据10株菌基因组序列的比较结果,初步对布鲁氏菌的全基因和共有基因进行了分析,其中全基因为4815个,共有基因为2231个,差异分布的基因占了53.7%,分析结果表明不同种型的布鲁氏菌在基因水平上仍存在较大的差异。从差异基因的染色体分布看,II号染色体上差异基因密度远远高于I号染色体,表明绝大部分差异分布的基因位于II号染色体上,这与以往研究认为的II号染色体是布鲁氏菌的一个大质粒的观点是一致的。通过基因组的比较,鉴定出一些在不同菌株中分布的连续基因,这些连续的基因同时存在或缺失,将这些连续基因形成的区段称为差异区段。通过分析,共发现有46个差异区段,这些差异区段所含有的基因数量从2个到41个不等。为了验证这些差异区段在不同种型的菌株中是否存在差异分布,我们根据差异区段的组成,从每个差异区段中选取了2个基因作为代表基因,设计引物进行PCR扩增,分析各个差异区段在6个经典种19个生物型的布鲁氏菌株中的分布。经过分析,发现其中42个差异区段的代表基因均能够被检测到同时存在或同时缺失,表明这42个是真正的差异区段。然后,对这42个差异区段的遗传特征进行了分析,发现其中大部分区段的GC含量低于染色体的平均GC含量,在其中16个差异区段的周围发现了重组酶和tRNA,这些遗传特征表明这些差异区段可能是从外部获得的。利用差异分布的差异区段,对不同种型的布鲁氏菌进行了聚类分析,结果显示,牛种和羊种布鲁氏菌分别聚到了一起,但是猪种布鲁氏菌不同型之间的差异很大,分别与其它种型的布鲁氏菌聚在了一起。差异区段所含有基因的功能信息,以及差异区段在不同种型中的分布,反映了不同种型布鲁氏菌在基因水平的多态性,可能与其不同的生化特征、毒力表型有一定关系。布鲁氏菌种的分化一直是布鲁氏菌微进化研究的一个重要内容。基于全基因组序列的进化分析显示,绵羊附睾种布鲁氏菌是一种比较古老的布鲁氏菌,而牛种和羊种布鲁氏菌则是分化程度较高的种。为了进一步探讨布鲁氏菌分化过程中基因水平的变化,我们在上述分析的基础上,通过测定标准菌株的看家基因,构建不同种型布鲁氏菌的遗传进化树,并在此基础上对进化过程中基因的获得与缺失进行分析。根据文献调研,共选取了7个看家基因aroA、cobQ、dnaK、gap、glk、gyrB和trpE进行多态性分析。结果显示,每个基因的等位基因数从3到7个不等,其中trpE的等位基因数最少,只有3个,glk最多,有7个。根据每个基因的等位基因型,19株不同种型的标准菌株共分为了13个ST型,其中ST2(牛5和牛9)、ST12(羊2和羊3)各含2株;ST1(牛1、牛2和牛4)、ST6(犬、猪3和猪4)各含3株。Splitree分析显示19株布鲁氏菌形成了5个不同的分支,分别为牛种、猪种/犬种、沙林鼠种、羊种和绵羊附睾种分支,eBURST克隆群分析显示,19株布鲁氏菌形成了2个克隆群CC1和CC2,其中CC1主要是牛种的不同型的菌株组成,CC2主要有猪种和犬种的菌株组成。利用看家基因的串联序列,构建了菌株间的遗传进化树,从进化树上看,绵羊附睾种单独为一支,牛种和羊种菌聚为一支,猪种和犬种聚为一支,沙林鼠种为一支。在该进化树的基础上,进一步分析了差异区段的获得与缺失。所有的牛种菌和猪种菌共同缺失了DFR24、25、36、38、39和40,除绵羊附睾种以外的其它种型的细菌均缺失了DFR38和DFR39。而与其它细菌相比,绵羊附睾中特异缺失了13个DFR(DFR3,4,12,19,20,21,22,29,31,32,34,35和41),说明不同种型的标准菌株中存在规律性、特征性缺失。另一方面,我们也发现了一些DFR在不同菌株中分布不同,某些DFR只在特定的菌株中缺失,有的只在部分分支中缺失,并且在距离较远的不同分支上存在相同的缺失,说明基因的获得与缺失是一个平行发生的过程,可能与宿主的适应性等密切相关。通过上述研究与分析,在本研究中我们对布鲁氏菌的基因组进行了系统的比较分析。结果表明尽管布鲁氏菌的基因组相对较为保守,但仍存在很大的差异,而这种差异主要来源于布鲁氏菌的II号染色体。在布鲁氏菌基因组中存在一些差异区段,其中部分差异区段具有外源DNA的特征,同时这些区段在不同菌株中的分布不同,表明这些差异区段是布鲁氏菌从外部获得的。与基于看家基因的进化树相比,部分差异区段在不同种型间存在规律性的分布,而另外一些差异区段的分布没有随进化关系而呈现获得与缺失的规律性变化。这种分布表明,基因的获得与缺失更可能与细菌的适应性相关。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1、布鲁氏菌的发现简史与病原生物学特性
• 2、布鲁氏菌分类学地位
• 3、布鲁氏病流行病学情况
• 4、本研究的目的与意义
• 第一章 布鲁氏菌的基因组比较分析
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二章 差异区段的验证及其在不同种型标准菌株中的分布
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三章 不同种型布鲁氏菌标准菌株间基因的获得与缺失
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 总结
• 参考文献
• 综述 布鲁氏菌基因组研究进展
• 参考文献
• 论著 不同种型布鲁氏菌间的基因获得与缺失研究
• 个人简历
• 在读期间发表的论文
• 致谢