牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3 B细胞线性表位的鉴定

论文摘要

牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus）隶属于黄病毒科（Flaviridae）、瘟病毒属（Pestivirus）。该病毒可以造成牛只的持续性感染,并且不表现出显著的症状,也可引发牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea, BVD）,临床表现为白细胞减少、黏膜糜烂溃疡、腹泻及怀孕母牛流产或产出畸形胎。该病的流行已经给世界养牛业造成了巨大的经济损失。NS3蛋白具有较高的免疫原性,在病毒感染过程中,免疫系统的CD4+ T细胞主要识别NS3和E2两种蛋白,并可诱导免疫细胞产生针对该蛋白的抗体。因此检测NS3蛋白抗体水平可以作为检测牛病毒性腹泻病毒感染的有效指标之一。本研究利用大肠杆菌表达系统分段表达重组NS3蛋白,利用标准阳性血清筛选NS3蛋白B细胞线性表位区,共筛选出6段具有反应原性的蛋白肽段;（1VCKKITEHERCHVNI15）,（20AFFGVMPRGTTPRAPVR36）,（46RRGLETGWAYTHQGGI61）,（281EGDMATGITYASYGYFC297）,（426YSGEDPANLRVVTSQSPYVVVATNAIESGV455）和（481FIVTGLKRMAVTVGEQA497）。筛选出的表位不但可以作为BVDV的检测抗原建立多种检测血清学检测手段,亦为今后开展非结构蛋白NS3的抗原结构甚至致病机理的研究提供理论依据。同时本研究应用套式RT-PCR方法扩增出牛病毒性腹泻病毒VEDEVAC株编码NS3蛋白的基因,克隆至表达载体pET-30a（+）,并进行测序。对瘟病毒属病毒NS3基因进行氨基酸差异性分析显示平均P-distance为0.07,基于NS3的系统进化树分析表明VEDEVAC株隶属于BVDV 1型。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 病毒的特性
• 1.1.1 病毒的分类地位
• 1.1.2 病毒的理化特征
• 1.1.3 病毒的生物型
• 1.2 BVDV 的基因组及其功能
• 1.2.1 BVDV 的结构蛋白
• 1.2.2 BVDV 的非结构蛋白
• 1.2.3 BVDV 的非编码结构
• 1.3 BVDV 的临床特征
• 1.3.1 急性临床症状及粘膜病
• 1.3.2 持续性感染
• 1.3.3 自然感染与自愈
• 1.4 BVDV 的预防及检测
• 1.4.1 BVDV 的疫苗
• 1.4.2 BVDV 的检测
• 1.5 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒与细胞
• 2.1.2 质粒与菌株
• 2.1.3 实验用血清
• 2.1.4 常用生物学试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 引物
• 2.1.7 Oligo 片段合成
• 2.1.8 生物信息学分析软件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 NS3 基因的RT-PCR 扩增与表达载体的构建
• 2.2.2 瘟病毒属基因差异性分析及基于BVDV NS3 基因的进化树的构建
• 2.2.3 NS3 基因片段的RT-PCR/PCR 扩增与表达载体的构建
• 2.2.4 NS3 基因片段的人工合成及表达载体构建
• 2.2.5 蛋白的原核表达和鉴定
• 2.2.6 原核表达蛋白的切胶纯化
• 2.2.7 原核表达蛋白的亲和层析纯化
• 2.2.8 蛋白纯化产物的western-blot 验证
• 2.2.9 蛋白纯化产物的western-blot 分析
• 2.2.10 目标蛋白的ELISA 分析
• 3 结果与分析
• 3.1 pET-30a（+）-NS3 重组质粒的鉴定
• 3.2 分段表达载体的测序结果
• 3.3 pET-30a（+）-NS3 重组质粒表达及纯化结果
• 3.4 瘟病毒属基因差异性分析
• 3.5 进化树的构建
• 3.6 分段蛋白纯化表达结果
• 3.7 表达纯化蛋白的western-blot 鉴定
• 3.8 表达纯化蛋白的western-blot 分析
• 3.9 目标蛋白的ELISA 分析
• 3.10 目标蛋白序列与瘟病毒属病毒序列的比对分析结果
• 4 讨论
• 4.1 NS3 全长蛋白的原核表达
• 4.2 NS3 蛋白的关键地位
• 4.3 基于NS3 核酸序列的进化树的构建
• 4.4 普通片段克隆策略
• 4.5 小于 60bp 片段的克隆策略
• 4.6 蛋白纯化方案的选择
• 4.7 表位的筛选
• 4.8 表位的预测
• 4.9 选择NS3 作为线性表位筛选对象的依据
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附件1
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文