利用sb401和pta基因同时改良水稻的蛋白质品质和抗虫特性

论文摘要

水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物之一,我国一半以上人口以稻米为主食。但水稻虫害的发生有时是灾难性的。据统计,如果不打农药,水稻每年因虫害造成的产量损失可达83%,而稻飞虱是为害水稻最严重的虫害之一,所以防治稻飞虱是增加产量的重要途径。化学农药的使用虽然能在某种程度上减少稻飞虱为害引起的损失,但同时又带来了诸如污染环境、危害人类健康等更为严重的问题。基因工程技术的出现和发展,为人类防治包括稻飞虱在内的水稻害虫提供了一条新的思路。 作为大多数人的主粮,水稻的高产稳产是人们首先所关注的。随着生活水平的提高,人们对稻米营养品质的要求也越来越高。其中,蛋白质和必需氨基酸是人们首先关注的营养特性。但是,水稻种子中蛋白质含量仅占粒重的5～10%,赖氨酸仅占蛋白质的3.5～4.0%,是第一限制性必需氨基酸。缺乏赖氨酸,会造成人体代谢紊乱,甚至引发某些生理机能性疾病。可见,稻米中赖氨酸的含量与以稻米为主食人群的健康息息相关。因而提高稻米中赖氨酸含量从而改良稻米蛋白质品质是水稻育种的重要目标。 利用传统育种手段或通过将含有不同外源基因的转基因植株进行有性杂交皆可同时改良水稻的抗虫特性、蛋白质品质等农艺性状,但两种方法的缺点都是育种周期长,见效慢。而将控制不同农艺性状的多个基因构建在同一载体的同一T-DNA上,导入目标水稻中,是同时改良水稻多个目标性状的一条有效途径。本研究利用农杆菌介导法,将构建在同一载体T-DNA上并分别由玉米泛素基因启动子Ubi和水稻胚乳特异表达启动子PGlu驱动的半夏凝集素抗虫基因（pta）和富含赖氨酸的马铃薯花粉特异水溶性蛋白基因（sb401）导入两个水稻品种中,其主要成果如下: 1.来源于粳稻日本晴和籼稻恢复系501R幼胚诱导的愈伤组织与农杆菌EHA105/pDB13PS共培养2～3d后,经25～45mg/L潮霉素筛选3次,从527块供试愈伤中共获得155块抗性愈伤（同本晴90块,501R 65块）,抗性愈伤率分别为63.38%和16.88%。抗性愈伤经分化培养,共获得70株独立转化的再生植株,PCR检测筛选出18株阳性苗,其中,日本晴13株,501R 5株,转化率分别为9.15%和1.30%。 2.随机抽取2株经PCR鉴定为阳性的植株和一株未转化植株提取总DNA进行Southern blotting分析,结果显示未转化植株无杂交条带,而转化阳性植株则1-2个拷贝,说明目的基因sb401和pta已经共整合到受体水稻基因组中。 3.提取2株的Southern blot阳性植株、1株pta基因PCR阳性植株与1株未转化

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• Ⅰ 文献综述
• 1. 基因工程发展概述
• 1.1 基因工程的诞生
• 1.2 植物基因工程的发展
• 1.3 水稻转基因技术的发展
• 2. 基因工程的操作步骤
• 2.1 目的基因的制备
• 2 1.1 鸟枪法
• 2.1.2 反转录法
• 2.1.3 聚合酶链式反应（polymerasechain reaetion, PCR）法
• 2.1.4 人工化学合成
• 2.2 目的基因与调控元件的组装
• 2.2.1 启动子
• 2.2.1.1 组成型启动子
• 2.2.1.2 特异性启动子
• 2.2.2 终止子
• 2.3 目的基因与载体连接成重组DNA
• 2.3.1 植物基因工程常用载体
• 2.3.1.1 质粒载体
• 2.3.1.2 噬菌体载体
• 2.3.1.3 柯斯质粒载体
• 2.3.1.4 植物病毒载体
• 2.3.2 目的基因与载体连接成重组DNA的方法
• 2.4 将重组DNA导入受体细胞
• 2.4.1 直接转化法
• 2.4.1.1 基因枪法（Gene gun-mediated transformation）
• 2.4.1.2 PEG诱导法（PEG-mediated transformation）
• 2.4.1.3 电击（激）法（Electroporation-mediated transformation）
• 2.4.1.4 花粉管通道法（Pollen tube-pathway transformation）
• 2.4.1.5 脂质体转化法（Liposome-mediated transformation）
• 2.4.1.6 激光微束介导基因转化（Microlazer-mediated transformation）
• 2.4.1.7 低能离子束介导法
• 2.4.2 间接转化法
• 2.4.2.1 根癌农杆菌介导转化法（Agrobacterium-mediated transformation）
• 2.4.2.2 其它间接转化方法
• 2.5 转基因植株的鉴定
• 2.5.1 外源基因整合的鉴定
• 2.5.1.1 PCR法
• 2.5.1.2 核酸分子杂交法
• 2.5.2 外源基因表达的鉴定
• 2.5.2.1 转录水平上的检测
• 2.5.2.2 翻译水平上的检测
• 2.5.3 转基因性状检测
• 3. 植物转基因沉默
• 3.1 转基因沉默的机制
• 3.2 克服植物转基因沉默的策略
• 3.2.1 转基因密码子优化及转化载体的合理修饰 使用增强子
• 3.2.2 在有性生殖后代中筛选单拷贝转基因个体
• 3.2.3 采用新的遗传转化方法以及在遗传转化方法上的改进
• 3.2.4 去甲基化试剂5-氮胞苷的使用
• 3.2.5 克服转基因沉默的其它方法
• 4. 转基因植物的安全性评价
• 4.1 转基因植物的环境安全性评价
• 4.1.1 转基因植物演变成农田杂草的可能性
• 4.1.2 基因漂流到近缘野生种的可能性
• 4.1.3 对自然生物类群的影响
• 4.2 转基因植物的食品安全性评价
• 4.2.1 有毒物质
• 4.2.2 过敏源
• 5. 基因工程在水稻育种中的应用
• 5.1 利用基因工程技术培育抗虫水稻品种
• 5.1.1 苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因（Bt基因）
• 5.1.2 蛋白酶抑制剂基因
• 5.1.3 植物凝集素基因
• 5.1.3.1 半夏凝集素Pta基因的研究进展
• 5.1.3.2 半夏凝集素pta基因的结构
• 5.1.3.3 Pta的作用机理
• 5.2 利用基因工程技术培育抗病水稻品种
• 5.2.1 抗病毒病基因工程
• 5.2.2 抗真菌病害基因工程
• 5.2.3 抗细菌病基因工程
• 5.2.4 抗线虫病基因工程
• 5.3 抗除草剂转基因
• 5.4 抗逆育种
• 5.5 品质育种
• 5.5.1 淀粉品质改良
• 5.5.2 增加稻米中赖氨酸和蛋白质的含量
• 5.5.2.1. sb401基因的研究进展
• 5.5.2.2. sb401基因的结构
• 5.5.3 增加稻米中维生素的含量和种类
• 5.5.4 增加稻米中微量矿质营养元素的含量
• 5.6 植物生物反应器
• 5.7 创造不育系和提高水稻产量潜力方面的应用
• 6. 立题思想
• Ⅱ 材料与方法
• 1. 实验材料
• 1.1 水稻材料
• 1.2 质粒和菌株
• 1.3 培养基成分
• 1.3.1 水稻转化培养基
• 1.3.2 细菌培养基
• 1.4 重要试剂及溶液
• 1.4.1 重要试剂
• 1.4.2 重要溶液
• 1.5 重要仪器设备
• 2. 实验方法
• 2.1 愈伤组织的诱导和继代培养
• 2.2 愈伤转化与抗性筛选
• 2.3 分化和生根
• 2.4 再生植株的 PCR检测
• 2.4.1 微量法提取水稻基因组 DNA
• 2.4.2 PCR检测
• 2.5 Southem blot分析
• 2.5.1 大量法提取水稻基因组 DNA
• 2.5.2 DNA限制性酶解
• 2.5.3 凝胶电泳
• 2.5.4 对电泳后凝胶的处理
• 2.5.5 毛细管印迹
• 2.5.6 预杂交
• 2.5.7 标记探针
• 2.5.8 杂交
• 2.5.9 洗膜
• 2.5.10 显影
• 2.6 RT-PCR检测
• 2.6.1 转基因植株 RNA提取
• 2.6.2 反转录反应
• 2.6.3 PCR反应
• 0代转基因植株成熟种子总蛋白和赖氨酸含量的测定'>2.7 T₀代转基因植株成熟种子总蛋白和赖氨酸含量的测定
• 0代自交种的 Hyg抗性发芽实验及遗传分析'>2.8 转基因植株 T₀代自交种的 Hyg抗性发芽实验及遗传分析
• Ⅲ 结果与分析
• 1. 转基因植株的获得
• 2. 再生植株的分子检测
• 0代再生植株的 PCR检测'>2.1 T₀代再生植株的 PCR检测
• 0代转基因植株的 Southern检测'>2.2 I T₀代转基因植株的 Southern检测
• 2.3 RT-PCR分析
• 3. 转基因植株种子赖氨酸和总蛋白的检测
• 4. 潮霉素抗性发芽实验及遗传分析
• Ⅳ 讨论
• 1. 愈伤组织的褐化问题
• 2. sb401基因改良水稻蛋白质品质
• 3. 关于多基因聚合的应用
• 4. 后续研究设想
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 硕士期间发表的学术论文