组织细胞核糖核苷酸还原酶活性测定标准方法的建立及其应用

论文摘要

核糖核苷酸还原酶（Ribonucleotide reductase, RR）功能是将四种核糖核苷酸（NDPs）经还原反应生成相应的脱氧核糖核苷酸（dNDPs）,为DNA合成提供原料。抑制RR活性使DNA合成受阻,最终引起细胞的死亡。人类的RR由大亚基RRM1与小亚基RRM2或RRM2B组成,形成两种不同形式RR酶,即RRM1/RRM2和RRM1/RRM2B。RRM1亚基结构上包含一个酶活性部位（Active site）和两个别构调节部位（Activity site和Specificity site）。RRM2和RRM2B亚基单体的蛋白质序列同源性约80%,均具有一个铁氧中心（Fe-O-Fe）和一个稳定的酪氨酰自由基（Tyr-0·）结构,而这两个结构为RR酶活性所必需。RR活性的增加与肿瘤的发生发展、转移和药物抗性密切相关。因此RR是重要的抗肿瘤药物分子靶点。羟基脲（Hydroxyurea）是RR抑制剂,临床应用于肿瘤治疗已有几十年历史。羟基脲作用主要机制是将自身的一个电子转移到RR小亚基酪氨酰自由基使其还原灭活,并可还原铁中心使其丢失结合的铁离子而抑制RR活性,从而阻止DNA的合成。然而,羟基脲极易产生抗药性。Triapine （3-AP）是正在进行临床II期试验的抗肿瘤新药。Triapine属于铁离子鳌合剂,其作用机制主要是形成Triapine-Fe （Ⅱ）复合物产生ROS,从而抑制RR小亚基的铁-酪氨酰自由基中心。Triapine对RR和肿瘤细胞生长抑制能力比羟基脲高100-1000倍,羟基脲耐药肿瘤细胞系对Triapine高度敏感。DFO （Desferrioxamine）也是铁离子鳌合剂,通过鳌合铁离子阻止RR小亚基铁中心的形成和再生,从而抑制RR活性。我们实验室已经应用大肠杆菌表达纯化的三种RR亚基重组蛋白,建立了两种重组RR酶活性试验方法,进行体外RR结构功能的研究以及RR靶向抗肿瘤新药药物的筛选。在此基础上,本论文进一步建立了组织细胞RR酶活性试验的标准方法,结合定量RT-PCR、免疫印迹试验以及重组RR酶活性试验等方法,分析临床肿瘤组织细胞中三种RR亚基的表达水平和两类RR酶活性的异常、评价RR抑制剂活性以及羟基脲耐药机制。主要结果如下：（1）组织细胞RR酶活性试验方法建立和标准化：比较不同组织细胞蛋白提取方法,根据免疫印迹和RR酶活性检测,确定先以1%硫酸链霉素沉淀去除核酸小分子,再用40%饱和硫酸铵沉淀提取纯化组织细胞蛋白,检测酶活性,建立标准细胞RR酶活性试验方法。（2）肿瘤组织RR酶活性和RR亚基表达水平：三例肝癌旁正常组织和癌组织蛋白,有两例病人癌组织中RRM1和RRM2的表达均有上调,RRM2B在这两例病人中差异不是特别明显,RR酶活性结果显示在肿瘤组织中酶活性均有明显上调。三例结肠癌旁正常组织和癌组织,RR三亚基蛋白表达也有一定差异,癌组织中酶活性都有明显的上调。结直肠癌和肝癌组织初步分析表明,RR酶活性与RR亚基表达水平与在不同类型肿瘤、不同病例中可能存在不同规律。结果表明应用我们首建的组织细胞RR酶活性试验方法,可测定临床组织RR酶活性；结合免疫印迹试验,可分析肿瘤组织两种RR酶活性和RR三种亚基表达水平改变,为全面分析RR与肿瘤的关系提供了新的方法。（3）组织细胞RR酶活性抑制试验与药物敏感性：应用组织细胞RR酶活性试验检测DFO、HU、3-AP和BSO的抑制活性,结果显示DFO和BSO对组织细胞RR酶具有较强的抑制作用。该结果也表明组织细胞RR酶活性试验方法可体外测定RR抑制剂敏感性,为临床个体化治疗、以及新药的筛选提供新的方法。（4）肿瘤细胞RR抑制剂耐药性机制：建立了具有羟基脲抗性的口咽癌细胞株（KB-HU）,并对其生物学特性进行研究。结果表明,KB经HU诱导形成具有稳定耐药性的KB-HU细胞之后,RRM1和RRM2B在mRNA水平变化不大,而RRM2在mRNA水平有3倍的上调；KB-HU细胞中RRM2蛋白表达量明显上调,RRM1和RRM2B蛋白表达变化不大；与KB细胞相比,KB-HU细胞RR酶活性提高约3倍。推测与HU抗性直接相关的是RRM2表达增加和RRM1/RRM2酶活性的增强,这可以部分解释KB-Hu细胞产生抗性的分子机制。KB-HU细胞GO/G1期和S期细胞比例具有显著性差异,KB的G1期细胞分布少于KB-Hu细胞,而S期细胞明显多于KB-HU细胞。这也就说明了HU对细胞周期的改变产生了一定的影响。结论：我们建立了应用1%硫酸链霉素+40%饱和硫酸铵沉淀法提取组织细胞蛋白、测定组织细胞RR酶活性的标准方法；结合定量RT-PCR和免疫印迹试验,可分析肿瘤组织细胞中三种RR亚基的表达水平,确定RR酶活性异常类型。组织细胞RR酶活性试验标准方法的建立,可深入研究两种RR及其三种亚基蛋白在肿瘤发病中的作用和机制；指导临床RR抑制剂的合理应用,进行肿瘤组织药敏试验,开展肿瘤个体化治疗；并可与其它方法结合,组合用于RR亚基特异性性新药的筛选和评价。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语
• 目次
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果和讨论
• 3.1 结果
• 3.1.1 组织细胞RR不提取方法比较,建立并标准化细胞RR酶活性试验
• 3.1.2 组织细胞RR酶活性试验,结合免疫印迹试验,分析肿瘤RR 酶活性和RR亚基表达水平,确定RR酶活性异常类型,结合临床和病理资料分析与肿瘤发生发展和预后关系
• 3.1.3 组织细胞RR酶活性抑制试验,作体外肿瘤组织药敏试验,分析RR抑制剂、以及各种抗肿瘤药物组合的敏感性
• 3.1.4 肿瘤细胞RR抑制剂耐药性机制
• 3.2 讨论
• 4 结论和展望
• 4.1 主要结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 作者简历及在学期间取得的科研成果