我国梨树轮纹病和干腐病病原菌的遗传多样性及分子特点研究

论文摘要

梨是我国的第三大果树,中国梨栽培面积和总产量均居世界前列。轮纹病和干腐病是梨树上发生普遍的两种病害,主要危害梨树枝干和果实,对梨树生长势和产量造成严重影响。两种病害在枝干上的症状表现存在明显差异,前者产生轮纹状病斑,后者在枝干上产生溃疡病斑,但二者引起的果实腐烂症状相似。已有研究表明,引起这两种病害的病原菌在形态学和生物学上相似,因此有关这两种病害的病原菌的分类特点仍存在异议。为了进一步明确我国发生的梨轮纹和干腐病的病原特性,本研究从我国梨主要产区收集了两种病害样品,对其病原菌进行了生物学和分子特性等方面的比较分析,主要结果如下：1.从所收集的梨样品中分离获得梨轮纹病菌菌株44个和梨干腐病菌菌株26个,在PDA培养基上对其培养特性进行了观察,结果显示,各菌株菌落形态相似,初期为白色,逐渐转为灰色或青灰色,最后至黑色,气生菌丝较多。少数菌株则表现为生长相对缓慢,菌丝气生性较差。分生孢子呈梭形或窄梭形、透明、薄壁、单胞,各菌株的分生孢子大小无明显差异,这些培养性状与引起苹果轮纹病的病原（B.dothidea）相似。2.选取部分代表性菌株进行梨活体和离体枝条及果实伤口接种菌丝体,致病性测定结果显示,这些菌株在所接种梨枝条及果实上均具有较强的致病性,其中在活体枝条上10 d后产生黑褐色条斑,并伴有病组织的突起；在离体枝条上4d后开始产生坏死病斑,后期病斑呈黑褐色；在果实后2d即产生褐色同心轮纹状病斑,果实迅速腐烂,果面渗出黄白色粘稠液滴。3.根据已报道的rDNA-ITS、β-tubulin和EF1-α序列保守位点合成引物,对部分代表性菌株进行扩增,扩增产物的序列分析结果表明,各测定菌株的rDNA-ITS和β-tubulin序列高度相似,分别为99.4%-100.0%和99.5%-100.0%%。而EF1-α序列在菌株间存在一定的差异,为97.8-100%。采用neighbor-joining法构建rDNA-ITS、β-tubulin和EF1-α的系统发育树,发现所测定的梨树干腐病菌和轮纹病菌均与B.dothidea聚到同一组,而与同属的其他种遗传距离较远。这些研究结果表明,来自我国梨树的干腐病和轮纹病病原菌间无明显差异,且与B. dothidea高度相似。4.从50条随机引物中筛选出9条具有高度多态性的随机引物,采用这些引物对所分离的72株菌株进行RAPD分析,对多态性扩增条带采用UPGMA法构建聚类分析树状图,结果表明在0.89相似水平上,来自我国的轮纹病菌和干腐病菌菌株可分为27个亚群,表明菌株间存在丰富的遗传多样性,而且菌株间的遗传距离与菌株的地域和品种来源无明显的相关性。5.采用以上9条随机引物分别对梨轮纹病菌、干腐病菌和腐烂病菌的DNA混合池进行扩增,对轮纹病菌和干腐病菌DNA池产生的特异条带的扩增产物进行回收和测序,并根据所测序列设计了8对SCAR标记引物,经进一步对各梨轮纹病菌和干腐病菌扩增,筛选出可同时特异性检测来自梨树和苹果上这两类病菌的SCAR标记引物S105-3-1/S105-3-2。同时发现干腐病菌菌株间存在2种大小的SCAR标记产物,对其分别测序的结果显示,两种产物的大小分别为795 bp和664 bp,序列比对的结果表明二者相似性较低,为65.47%。进一步采用6条随机引物对表现两种不同SCAR标记的干腐病菌DNA混合池进行扩增的结果显示,干腐病菌的两个混合池扩增结果一致,表明这些病菌为同种病菌,且存在分子多态性,所获SCAR标记既可用于轮纹病菌和干腐病菌的检测,也可作为这类病菌的多态性标记。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1. 梨树轮纹病和干腐病研究概况
• 1.1 梨树轮纹病和干腐病的发生及危害
• 1.2 梨树轮纹病和干腐病的危害症状
• 1.3 梨树轮纹病和干腐病的病原学研究
• 1.3.1 病原菌
• 1.3.2 生物学特性
• 1.4 RAPD分析和SCAR标记技术在植物病原真菌遗传多样性研究中的应用
• 1.4.1 RAPD分析
• 1.4.2 SCAR标记
• 1.5 研究目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 研究材料
• 2.1.1 标本采集
• 2.1.2 试剂
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 供试菌株分离、纯化和保存
• 2.2.2 病原菌的形态学鉴定
• 2.2.2.1 PDA培养基上病原菌菌落形态观察
• 2.2.2.2 孢子形态观察
• 2.2.3 梨树干腐病菌和轮纹病菌菌株生长特点
• 2.2.4 分离株致病性测定
• 2.2.4.1 活体枝条接种
• 2.2.4.2 离体枝条接种
• 2.2.4.3 离体果实接种
• 2.2.5 rDNA-ITS、β-tubulin和EF1-α鉴定
• 2.2.5.1 基因组DNA的提取
• 2.2.5.2 引物设计与合成
• 2.2.5.3 PCR扩增
• 2.2.5.4 PCR产物的回收与纯化
• 2.2.5.5 连接
• 2.2.5.6 热击转化
• 2.2.5.7 阳性克隆的PCR鉴定
• 2.2.5.8 序列测定和系统进化树分析
• 2.2.6 RAPD分析和SCAR标记
• 2.2.6.1 供试菌株
• 2.2.6.2 基因组DNA的提取及菌株DNA池的构建
• 2.2.6.3 RAPD扩增反应条件及体系
• 2.2.6.4 RAPD随机引物的筛选
• 2.2.6.5 供试菌株RAPD聚类分析
• 2.2.6.6 RAPD多态性片段的回收、克隆和测序
• 2.2.6.7 SCAR标记引物的设计与扩增
• 3 结果与分析
• 3.1 梨树轮纹病菌和干腐病菌分离结果
• 3.2 病原菌的形态学鉴定
• 3.2.1 PDA培养基上病原菌菌落形态观察
• 3.2.2 孢子形态观察
• 3.3 梨轮纹病菌和干腐病菌菌株生长特点
• 3.4 分离菌株致病性测定
• 3.4.1 活体枝条接种
• 3.4.2 离体枝条接种
• 3.4.3 离体果实接种
• 3.5 rDNA-ITS、β-tubulin和EF1-α鉴定
• 3.5.1 序列同源性分析
• 3.5.2 系统进化树分析
• 3.6 RAPD分析和SCAR标记
• 3.6.1 RAPD随机引物筛选结果
• 3.6.2 梨树轮纹病菌和干腐病菌分离株的RAPD分析
• 3.6.3 SCAR标记的转化
• 4 结论与讨论
• 参考文献
• 致谢