论文摘要
重症EV71脑炎是由肠道病毒EV71型感染引起中枢神经系统损害的重症疾病。EV71具有高度嗜神经特性,脑干（桥脑、延髓）和脊髓是其最常损害的区域,特别是脑干是最容易被感染的部位。临床表现主要以发热、手足口皮疹和神经系统异常等为特点,约三分之一感染者出现中枢神经系统受累表现,临床进展迅速,病死率及致残率高。据Ho M等统计,EV71发病率为0.055%0-0.093‰（平均0.078%。）,病死率为7.7-31.0%（平均17.8%）,尤其是婴幼儿感染EV71后病情往往较重,病死率较其它年龄组更高。在死亡人数中,6-12月婴儿占43.0%,小于6月婴儿占16.0%。幸存者多留有严重神经系统后遗症。文献报道,1998年台湾EV71流行中受累人数近150万人,因EV71感染导致脑干损害,出现神经源性肺水肿,其病死率高达64.3%。研究发现,17.0%-30.2% EV71感染患儿没有出现皮肤黏膜损害,临床症状不典型,而且在EV71流行过程中临床表现复杂、多样,差异较大。目前对重症EV71脑炎及脑损伤仍缺乏早期、敏感的评估手段,部分患儿因早期评估不足得不到及时和合理治疗而导致严重脑损伤,甚至死亡。因此,当务之急是寻求一种早期诊断重症EV71脑炎的手段和方法,这将对减少重症EV71脑炎病死率和致残率有着重要意义。自1969年,美国加利福尼亚分离得到首株EV71以来,EV71已在全球范围内引起10多次暴发和流行,4次为较大规模的流行,如1975年保加利亚,1978年的匈牙利,1997年的马来西亚,其中1998年中国台湾爆发EV71感染的405例住院患儿中,死亡人数达78例。我国大陆地区于1981年首次报道手足口病,1998年在广东首次鉴定出EV71（C4亚型）病毒。2008年,我国大陆地区出现的EV71流行波及全国20多个省、市和自治区,近500000人受累,报道死亡人数为126人。近年来,EV71流行呈上升趋势,并发中枢神经系统损害的重症感染病例越来越多。重症EV71脑炎已经严重威胁到儿童的生命安全,成为国内外广泛关注和研究的热点。迄今,对EV71感染导致中枢损害的确切发病机制尚不完全清楚,临床仍缺乏重症EV71脑炎的早期客观诊断手段和方法。研究证实,在许多疾病中功能代谢的变化先于病理形态学的改变,1H-MRS作为一种无创活体影像学检查技术,能够定量分析局部脑组织生化代谢功能,能在感兴趣区内对一系列生化代谢物质如NAA、Cho等种类和数量改变及其代谢物比值NAA/Cr、Cho/Cr、NAA/Cho比值等进行检测。NAA存在于成熟神经元和轴突内,是神经元和轴突标志物,主要反映神经元数量和功能；Cho是胶质细胞增生、髓鞘形成、细胞膜代谢指标,能反映神经细胞的损伤程度；NAA/Cr比值越低提示神经元细胞损伤越严重,Cho/Cr比值反映胶质细胞的活化及增殖程度,与神经损伤后的代偿修复有关,NAA/Cho和NAA/Cho+Cr比值提示病灶内神经元丢失、功能障碍和胶质细胞活化的指标。所以,’H-MRS使脑损伤的研究从单纯形态学观察进入到分子代谢水平,为本质上揭示疾病的发生机制提供新的研究手段。临床研究和动物实验均证实在形态学发生改变之前,1H-MRS已可检测到脑组织的异常代谢,并能反映早期脑组织内的超微结构改变,对脑损伤的病情发展能够作出准确估测。1H-MRS所检测到的代谢变化明显要早于CT或MRI所观察到的形态学改变,因此,利用’H-MRS检测疾病发生时的代谢物质差异可以对重症EV71脑炎的神经病理损伤机制进行无创的影像学研究,将对重症EV71脑炎及脑损伤的早期诊断和病情判断有重要临床指导意义。NSE、MBP和S-100β是目前公认的评估神经元、髓鞘、胶质细胞损伤的生物学标志物。NSE主要存在于中枢神经元和神经内分泌细胞,是目前唯一能特异性反映神经元损伤的标志物。研究证实,NSE释放量与神经细胞的死亡数量呈显著相关性,其含量可早期直接反映神经元受损程度。S-100β在CNS主要由星形胶质细胞合成与分泌,高浓度S-100β具有神经毒性。研究发现,细胞外高浓度S-100p可以刺激炎症因子表达,导致细胞凋亡。脑损伤患者在影像检查未发现异常前血清S-100p即有显著升高。小鼠脑损伤模型研究显示,血清和脑脊液S-100β水平呈良好相关性,血清S-100β是早期评价亚临床脑损伤的有效标记物。MBP由少突胶质细胞合成和分泌,参与髓鞘形成,是反映CNS有无实质性损害,特别是有无髓鞘脱失的特异性标志物。因此,通过检测重症EV71脑炎患儿脑脊液和血清MBP、NSE和S-100p浓度,可以对包括神经元、胶质细胞（星形胶质细胞和少突胶质细胞）、髓鞘等在内的细胞损伤机制进行研究,有助于重症EV71脑炎及脑损伤的临床诊断及预后评估。至今国内外尚未见应用1H-MRS和神经生物标记物针对重症EV71脑炎研究的报道。本课题拟通过检测重症EV71脑炎脑干’H-MRS代谢物含量及血清和脑脊液神经损伤标志物浓度改变,探讨重症EV71脑炎的神经细胞损伤机制及临床应用价值,从而为本病的发病机制提供理论依据及临床分期和预后判断提供一种新方法。目的通过检测急性重症EV71脑炎患儿脑内’H-MRS生化代谢变化及血清、脑脊液的NSE、MBP、S-100β含量改变,探讨重症EV71脑炎的神经细胞损伤机制及其在疾病分期和预后判断中的意义。方法1.选取2010年6-12月在我院儿童危重症监护室住院诊断和治疗的重症EV71脑炎25例患儿作为病例组,取肛拭子或粪便样本检测EV71特异性病毒核酸均为阳性。男性13例,女性12例,年龄5月-36月,平均年龄18.3月。参照卫生部《肠道病毒（EV71）感染诊疗指南（2008年版）》,根据患儿起病7天内病情分为重症组16例,危重症组9例；参照Lin TY[33]对入选病例进行临床分期诊断：16例为Ⅱ期,Ⅲa期5例,Ⅲb期4例。10例无异常神经系统症状体征的儿童,经家长同意作为正常对照组,进行对照研究。男性6例,女性4例,年龄6月-35月,平均年龄18.1月。2.全部对象完成常规MRI和’H-MRS检查,MRI检查采用Philip Achieva3. OT超导成像系统,横断位快速自旋回波T2WI、T1WI、液体衰减反转恢复T2WI（T2-FLAIR）以及横断位、冠状位、矢状位自旋回波T1WI增强检查。横断位T2WI/FSE （TR 4114ms, TE 110ms）, T1WI/SE （TR 488ms, TE 15ms）, T2-FLAIR （TR=6000ms, TE=120ms, TI=2000ms）, FOV=24cm×24cm,矩阵=384×381,层厚=5.0mm,层间距=1.0mm。1H-MRS采用单体素点分辨波谱分析法（PRESS）,扫描参数：TR=1500ms,TE=144ms,自动匀场与水抑制,采用Spectroview后处理软件包进行波谱后处理。选取脑干（桥脑和延髓）为主要感兴趣区。波谱主要测定指标为N-乙酰天门冬氨酸（NAA）、肌酸（Cr）、胆碱（Cho）等波峰下面积以及峰下面积比值NAA/Cr、Cho/Cr、NAA/Cho及NAA/Cho+Cr。两组间比较采用两样本t检验；多个样本均数间的多重比较,方差齐,采用LSD-t检验,方差不齐,采用Welch检验。分别比较病例组与对照组,重症组、危重症组与对照组,Ⅱ期、Ⅲa期、Ⅲb期脑内1H-MRS代谢物的差异。3.在起病7天内,分别采集病例组患儿静脉血4ml和脑脊液1.5ml 25人份,采集对照组儿童静脉血10人份。血标本经1000×g离心15分钟,取上清和脑脊液分别分装入EP试管,-80℃冰箱保存待测。采用酶联免疫吸附法（ELISA法）测定血清和脑脊液NSE、MBP、S-100β蛋白含量。两组资料均以均数±标准差表达,两组间比较采用两样本t检验,分别比较病例与对照组血清、脑脊液NSE、MBP、S-100p蛋白含量差异；多个样本均数间的多重比较,方差齐,采用LSD-t检验,方差不齐,采用Welch检验,分别比较重症、危重症、对照组,Ⅱ期、Ⅲa期、Ⅲb期血清NSE、MBP、S-100β蛋白含量差异；血清和脑脊液NSE、MBP、S-100β蛋白含量相关分析采用双变量相关分析（Pearson correlation, 2-tailed）, P≤0.05认为差别有统计学意义,P≤0.01认为差别有高度统计学意义。结果1病例组与对照组年龄、性别差异无统计学显著性差异（年龄t=0.048,P=0.962；性别x2=0.185,P=0.723）；对照组’H-MRS及MRI检查均未见异常。2.病例组1H-MRS检测结果2.1常规MRI扫描：异常共10例,5例出现脑干损害,3例合并脊髓损伤。病灶分布为：1例中脑、脑桥顶盖、延髓、颈髓C1-2、双侧枕叶；1例脑桥顶盖、延髓；1例累及延髓和脊髓C1-4；1例广泛累及颈髓6-7和胸髓1-12,胼胝体后部；1例双侧额、顶叶；1例双侧半卵圆中心,放射冠、脑桥、延髓、小脑蚯部；1例双侧额、枕、顶叶,以顶、颞叶明显；1例双侧额、顶、颞叶；1例双侧额、颞叶；1例延髓背侧。病灶信号强度表现为T1WI呈低信号或等信号,T2WI和T2/FLAIR呈高信号。2.2 1H-MRS检测：25例脑干1H-MRS表现为不同程度NAA降低和Cho升高,病例组与对照组相比：病例组NAA（0.23±0.05）低于对照组（0.29±0.07）（P<0.01）,Cho（0.33±0.04）高于对照组（0.27±0.05）（P<0.01）,NAA/Cr（1.36±0.32）低于对照组（1.89±0.25）（P<0.01）,NAA/Cho （0.48±0.11）低于对照组（0.71±0.17） （P<0.01）, NAA/Cho+Cr （0.71±0.17）低于对照组（1.02±0.28）（P<0.01）,Cho/Cr（1.90±0.4）稍高于对照组（1.80±0.34）（P=0.477）。2.3重症组与危重组1H-MRS代谢物比值变化：危重组Cho/Cr明显升高（P<0.05）,重症组Cho/Cr仅轻度增高（P>0.05）,危重组NAA/Cr、NAA/Cho、NAA/Cho+Cr显著降低（P<0.05,P<0.05,P<0.05）。2.4不同临床分期1H-MRS代谢物比值变化：Ⅱ期及Ⅲ期（Ⅲa和Ⅲb）与正常对照组相比：Ⅱ期Cho/Cr增高（P>0.05）,Ⅲ期Cho/Cr显著增高（P<0.05）。Ⅲa期与Ⅱ期比较Cho/Cr增高,NAA/Cho+Cr、NAA/Cho降低（P<0.01,P<0.Ol,P<0.05）,Ⅲb期与Ⅱ期比较:NAA/Cr、NAA/Cho、NAA/Cho+Cr降低,Cho/Cr增高（P均<0.01）。Ⅲa期与Ⅲb期相比：Ⅲb期NAA/Cr、NAA/Cho+Cr降低（P<0.01, P<0.05）, Cho/Cr无显著性差异（P>0.05）。3脑损伤标志物检查结果3.1直线相关分析显示：NSE、MBP、S-100β血清与脑脊液含量关系呈正相关,r值分别为0.806,0.671,0.802（P均<0.01）。3.2病例组与对照组血清神经标志物结果：病例组NSE（7.46±2.74）和S-100β（529.85±192.90）含量分别高于正常对照组,NSE（4.13±0.68）和S-100β（325.61±63.14）含量,两组间差异有高度统计学意义（P均<0.01）,病例组MBP（1.45±0.79）含量与正常对照组MBP（1.22±0.56）含量差异无统计学意义（P=0.409）。3.3危重组NSE、MBP和S-100β三者含量均显著增高,与正常对照组相比,NSE（10.34±1.50）（P<0.01）,MBP（1.95±0.48）（P<0.05）,S-100β蛋白（744.31±101.57）（P<0.01）,重症组仅NSE和S-100β含量增高,NSE（5.80±1.70）（P<0.05）和S-100p（409.22±104.50）（P<0.05）。与重症组相比,危重组NSE、MBP和S-100β三者含量均增高,差异均有高度统计学意义（P<0.01）。3.4不同期NSE、MBP和S-100p含量：Ⅲb期>Ⅲa期>Ⅱ期。Ⅱ期及Ⅲ期与对照组相比,Ⅱ期NSE、S-100p与Ⅲ期NSE、MBP和S-100p含量显著增高,差异均有高度统计学意义（P<0.01）。Ⅲb期与Ⅲa期相比,NSE、MBP和S-100β三者含量差异无统计学意义（P>0.05）。结论1.在重症EV71脑炎急性期,’H-MRS特征性表现为NAA/Cr、NAA/Cho、NAA/Cho+Cr比值下降,提示早期以神经元损害为主,神经元丢失或者功能障碍；危重症患儿可伴Cho/Cr比值增高,提示胶质细胞增生或髓鞘破坏。病情越重,1H-MRS代谢改变越明显,预后愈差。2.病例组血清和脑脊液NSE、S-100β蛋白含量显著增高,提示中枢神经元细胞和胶质细胞（星型）均有损伤：危重症患儿可伴MBP含量明显增高,提示存在少突胶质细胞损伤或髓鞘破坏。脑脊液或血清NSE、S-100β和MBP水平与疾病严重程度有关。3.血清与脑脊液NSE、MBP、S-100β蛋白含量呈显著性正相关。监测血清含量可间接评估EV71脑炎及脑损伤的严重程度。4.1H-MRS有助于弥补MRI不足,作为一项无创检查,可为重症EV71脑炎脑损伤提供活体的病理诊断,为疾病严重程度及预后判断提供客观定量的依据。5.1H-MRS结合MRI可为重症EV71脑炎的诊断和治疗提供定位诊断和功能诊断的影像学客观依据。
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