家蚕RPA43相关基因（BmRPA43 N）的克隆表达及定位分析

论文摘要

A43蛋白是酵母RNA聚合酶Ⅰ（polⅠ）特有的一个亚基,由RPA43基因编码,能与转录因子Rrn3相互作用,将polⅠ带到rDNA启动子上,从而起始转录。A43亚基是polⅠ中各亚基组装及polⅠ-Rrn3复合物稳定性的决定物质。A43蛋白有两个结构域,N-端RNP结构域（RNAPIRpa43N）和C-端寡核苷酸（OB）结合结构域。迄今在哺乳动物、禽类及两栖类中发现了一个只含有A43蛋白N-端结构域的蛋白,Twist Neighbor（TWISTNB）蛋白,其编码基因的突变可导致患者学习能力障碍,可能为一种新型微缺失综合症。目前尚未见有该蛋白在昆虫中的相关报道。从本实验室构建的家蚕cDNA文库中筛选到一个基因序列,其开放阅读框（ORF）为630 bp,编码209个氨基酸残基,预测蛋白分子量为23.77 kD。通过生物信息学分析,发现该基因编码的蛋白与其他物种中相关蛋白的同源性很低,却含有RNAPIRpa43N保守结构域,故将其命名为BmRPA43N（Bombyx mori RPA43N）,基因登录号为:GU288816。将BmRPA43N基因克隆到表达载体pET-28a（+）相应的酶切位点上,成功构建了融合蛋白表达质粒pET-28a（+）-BmRPA43N。该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）后诱导表达,SDS-PAGE结果显示,在预期位置有一特异性蛋白条带,且该融合蛋白在裂解菌液的上清和沉淀中均有存在。对经Ni2+亲和层析柱纯化的蛋白进行FPLC反相柱分析,测得其纯度在90%以上;质谱鉴定该融合蛋白的分子量与理论值非常相近,说明BmRPA43N基因表达成功。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫雄性新西兰兔,制备多克隆抗体,采用间接ELISA法测得其效价在1:12800以上,Western blotting检测表明抗体的特异性良好。运用Western blotting和实时荧光定量PCR技术,发现BmRPA43N在不同发育阶段转录和表达水平差异较大,其中表达量卵期最高,蛾期最低;而在五龄幼虫不同组织中则为血液中最高,脂肪体中最低。亚细胞定位分析结果显示,BmRPA43N蛋白主要分布在细胞质中。根据本文实验获得的结果,推测BmRPA43N在家蚕的生殖发育过程中具有十分重要的作用,其具体功能有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• N 蛋白研究进展'>第一章 Bm RPA43_N蛋白研究进展
• 引言
• 1 A43 蛋白的发现与命名
• Rp67_Nlike 超家族'>2 RNAP_Rp67_Nlike 超家族
• 3 A43 在RNA 聚合酶Ⅰ中的结构特征
• 3.1 RNA 聚合酶Ⅰ
• 3.2 A43 和A14 能形成稳定的异源二聚体
• 3.3 A43 亚基在RNA 聚合酶三维结构中的定位
• 4 A43 蛋白的生物学功能
• 5 微缺失综合症与TWISTNB（twist neighbor）基因
• 5.1 微缺失综合症
• 5.2 TWISTNB（twist neighbor）基因
• 6 研究现状及展望
• 第二章 实验方案设计
• 1 研究目的和意义
• 2 主要研究内容
• 3 实验流程图
• 第三章 生物信息学分析
• 1 序列与生物信息学工具
• 1.1 序列
• 1.2 生物信息学工具
• 2 方法
• 3 结果
• N 的基因序列及结构分析'>3.1 BmRPA43_N的基因序列及结构分析
• N 的氨基酸序列分析'>3.2 BmRPA43_N的氨基酸序列分析
• 3.3 疏水性分析
• 3.4 跨膜区分析
• 3.5 信号肽预测
• N 蛋白在细胞内定位的预测功能位点预测'>3.6 BmRPA43_N蛋白在细胞内定位的预测功能位点预测
• 3.7 功能位点预测
• N 蛋白二级结构的预测'>3.8 BmRPA43_N蛋白二级结构的预测
• N 蛋白高级结构的预测'>3.9 BmRPA43_N蛋白高级结构的预测
• N 蛋白氨基酸序列同源性分析'>3.10 BmRPA43_N蛋白氨基酸序列同源性分析
• 4 讨论
• N 基因的克隆与原核表达'>第四章 BmRPA43_N基因的克隆与原核表达
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料与设备
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 2 方法
• N 基因重组质粒的构建'>2.1 BmRPA43_N基因重组质粒的构建
• N 基因序列的测定'>2.2 BmRPA43_N基因序列的测定
• 2.3 重组质粒转化大肠杆菌表达菌株
• 2.4 融合蛋白的诱导表达
• 3 结果
• 3.1 PCR 扩增目的片段
• N 的双酶切鉴定'>3.2 重组质粒pET-28a（+）-BmRPA43_N的双酶切鉴定
• 3.3 序列测定
• N 的诱导表达'>3.4 pET-28a（+）-BmRPA43_N的诱导表达
• 4 讨论
• 第五章 多克隆抗体的制备及鉴定
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料与设备
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 Ni 柱亲和层析纯化融合蛋白
• 2.2 融合蛋白的FPLC 纯化和质谱鉴定
• 2.3 多克隆抗体的制备
• 2.4 抗体的效价和特异性检测
• 3 结果
• 3.1 融合蛋白的纯化
• 3.2 FPLC 分离纯化
• 3.3 质谱鉴定
• 3.4 抗体的效价测定
• 3.5 抗体特异性检测
• 4 讨论
• N 蛋白的表达分析'>第六章 Bm RPA43_N蛋白的表达分析
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料与仪器
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 总蛋白的提取及定量
• N 蛋白在家蚕各发育时期的分布'>2.2 Western blotting 检测 BmRPA43_N蛋白在家蚕各发育时期的分布
• N 蛋白在家蚕各组织的分布'>2.3 Western blotting 检测 BmRPA43_N蛋白在家蚕各组织的分布
• 2.4 总RNA 的提取及定量
• N 在家蚕各时期及五龄幼虫各组织中的分布'>2.5 荧光定量PCR 检测BmRPA43_N在家蚕各时期及五龄幼虫各组织中的分布
• 3 结果
• N 在家蚕不同发育时期的转录和表达水平'>3.1 BmRPA43_N在家蚕不同发育时期的转录和表达水平
• N 在五龄幼虫不同组织内的转录和表达水平'>3.2 BmRPA43_N在五龄幼虫不同组织内的转录和表达水平
• 4 讨论
• 第七章 亚细胞定位分析
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 细胞总RNA 的提取
• N 基因'>2.2 RT-PCR 扩增BmRPA43_N基因
• 2.3 细胞质、细胞核蛋白的提取
• N 蛋白'>2.4 Western blotting 检测细胞中的BmRPA43_N蛋白
• 2.5 亚细胞定位
• 3 结果
• 3.1 细胞总RNA
• N 基因'>3.2 RT-PCR 扩增细胞中的BmRPA43_N基因
• 3.3 Western blotting 分析
• 3.4 亚细胞定位
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间发表的论文