银粉背蕨水分胁迫差异cDNA的研究BcWRKY Ⅱ基因及其5’调控区的克隆

论文摘要

1.银粉背蕨水分胁迫差异cDNA的研究银粉背蕨水（Aleuritopteris argentea（ Gmel））.它属蕨科粉背蕨属植物,具有典型复苏植物的特性,为了寻找该植物水分胁迫特异表达的基因,从分子水平阐明干旱作用的机理,研究干旱对该植物基因表达的影响。以银粉背蕨成熟孢子经过无菌处理,萌发为原叶体,利用水陪法培养三周,采用Conccert法从富含多糖和酚类物质的银粉背蕨中提取出高质量的RNA作为模板,利用mRNA差异显示技术的优化方法,如银染变性聚丙烯酰胺凝胶、地高辛标记反向Northern中的两个cDNA探针、优化PCR扩增程序等,分离到差异表达的3个阳性片段。从基因表达水平来说,1个在干旱处理后表达水平上调,一个表达水平下调,一个干旱诱导特异表达。测序后进行同源性比较,两个为未知基因,一个为与已知hypothetical protein同源性36%的基因。2.厚叶旋蒴苣苔BcWRKYⅡ基因及5’调控区的克隆WRKY蛋白为新近发现的植物特有的转录因子家族。已有报道这一基因家族参与多个生理过程,如病原防御,衰老以及表皮毛（trichome）发育。近年来发现WRKY基因也参与植物对逆境胁迫的反应。厚叶旋蒴苣苔（Boea crassifolia）属于苦苣苔科旋蒴苣苔属,为我国特有的物种,十分耐旱,主要分布在我国西南部的具石灰岩地貌的地区。它是一种复苏耐旱的植物,能在极端干旱条件下生存下来。基于WRKY家族的重要性我们依据WRKY蛋白的保守序列设计引物,利用RT-PCR的方法,用干旱诱导后的厚叶旋蒴苣苔为材料,提取总RNA,克隆了一个WRKY家族新成员BcWRKYⅡ基因的片断。序列分析表明所克隆的该基因属在WRKY家族group3。利用5’RACE技术得到了BcWRKYⅡ基因的全长cDNA。为进一步研究该基因的表达调控,在获得干旱诱导表达的BcWRKYⅡ基因全长cDNA之后,利用接头介导的PCR（LM-PCR）技术,克隆出BcWRKYⅡ基因的908bp的5’调控区序列,为进一步研究WRKY家族基因的转录调控机制研究奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 银粉背蕨水分胁迫差异cDNA 的研究
• 第一章 文献综述
• 第一节 银粉背蕨的研究进展
• 第二节 差异显示技术的研究进展
• 1. 差异基因克隆方法简介
• 2. 几种差异基因克隆方法介绍
• 3. mRNA 差异显示（DD）
• 第二章 试验研究
• 一、化学试剂和基本实验方法
• 二、基本实验方法
• 三、材料和方法
• 3.1 植物材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 本实验所用引物
• 3.2.2 银粉背蕨总RNA 的提取
• 3.2.3 m RNA 差异显示分析
• 3.2.4 差异条带的再次PCR 扩增
• 3.2.5 反向－Northern 确认阳性差异表达的片段
• 3.2.6 差异条带的克隆鉴定
• 3.2.7 差异显示cDNA 片段的序列分析
• 3.2.8 测序所得三个片断序列
• 四、结果与讨论
• 4.1 结果
• 4.2 讨论
• 参考文献
• 第二部分 厚叶旋蒴苣苔（Boea crassifolia）干旱诱导BcWRKYⅡ基因及5’调控区的克隆
• 第一章 文献综述
• 一、植物耐干旱胁迫的分子生物学机理
• 二、植物在干旱胁迫下诱导表达的基因及其产物
• 三、植物干旱胁迫诱导下基因的表达调控
• ㈠需要蛋白质合成的依赖ABA 基因表达途径（途径Ⅰ）
• ㈡水分胁迫期间依赖ABA 的基因表达途径（途径Ⅱ）
• ㈢不依赖ABA 的基因表达途径（途径Ⅲ和途径Ⅳ）
• 四、植物对干旱胁迫应答的信号传导途径
• ㈠利用MAPK的渗透/氧化胁迫信号途径
• ㈡DRE/CRT类型和LEA 类似基因的信号传导途径
• 五、植物抗旱基因工程的研究
• （一） 转化产生渗透保护成分的基因
• （二） 改造生物膜的流动性
• （三） 转化胁迫诱导的蛋白类基因
• 第二章 实验研究
• 第一节 厚叶旋蒴苣苔（Boea crassifolia）干旱诱导BcWRKYⅡ基因的克隆
• 一、试剂及基本实验方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 分子生物学及生化试剂
• 1.3 培养基
• 1.4 常用溶液
• 二、基本实验方法
• 三、材料和方法
• 3.1 植物材料
• 3.2 方法
• 四结果与讨论
• 4.1 结果
• 4.2 讨论
• 参考文献
• 第二节 厚叶旋蒴苣苔（Boea crassifolia） BcWRKYⅡ基因5’调控区的克隆
• 引言
• 1. 方法
• 2. 结果与讨论
• 2.1 结果
• 2.2 讨论
• 参考文献
• 本论文的创新点
• 致谢
• 作者简介
• 导师评阅表