论文摘要
背景、目的:海尔曼螺杆菌（Helicobacter heilmannii,H.heilmannii）,是除幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）以外的唯一能够在人胃定植的螺杆菌属细菌,被视为胃炎的可能病原体。H.heilmannii感染与胃多种病变相关:急慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃B细胞粘膜相关淋巴组织淋巴瘤,也有引起食管疾病的报道,其临床意义值得重视。与国外相比,我国有较高的H.heilmannii感染率（欧美0.25%～0.95%,国内1.78%～7.32%）。随着H.pylori的发现获得诺贝尔奖,H.pylori与慢性胃病的关系已得到广泛认同,抗菌治疗己成为常规。在大规模除菌治疗多年后的今天,H.heilmannii的流行情况发生了什么变化却不得而知。至今为止,H.heilmannii仍不能在体外培养成功,快速诊断还是主要依靠切片染色的形态学方法。目前国外研究大多集中于流行病学调查,个案报道以及分子鉴定,国内自94年后的研究一直处于空白,H.heilmannii的致病机制尚不明确,目前世界上尚未建立稳定传代的H.heilmannii菌株。因此,构建H.heilmannii能持久定植的实验动物模型、建立体外培养的稳定方法就显得尤为重要,成为深入研究的必要手段和必然途径。此次研究的目的:了解目前国内H.heilmannii的流行情况;体外培养H.heilmannii;建立H.heilmannii长期感染小鼠的实验动物模型;初步研究其致病机制。材料和方法:1.收集南方医院消化科2005-2006年行上消化道电子胃镜活检的2339例患者以及1994年1-4月819例患者的临床资料、内镜资料、病理标本。2.筛检H.heilmannii感染患者:对2007年1-6月行上消化道电子内镜检查的703例胃镜受检者行胃粘膜涂片染色,镜下根据H.heilmannii典型形态筛选阳性患者,获取H.heilmannii感染患者的胃粘膜活检标本并在小鼠体内传代保存。3.在多种培养基和多种气体条件以及不同温度条件下对成功定植H.heilmannii的鼠胃粘膜组织进行细菌的分离培养。4.建立H.heilmannii长期感染小鼠模型:4～6周龄健康雄性BALB/c小鼠、雌性C57BL/6小鼠、雄性裸鼠各36只（SPF）,分别随机分为实验组（n=30）和正常对照组（n=6）。实验组灌注H.heilmannii匀浆液0.2ml/只,并于灌胃后第4、8、12、24、36周分别处死6只。正常对照组分别灌注无菌布氏肉汤0.2ml/只,于实验第4、12、36周（裸鼠为4、8、12周）分别随机处死2只。观察细菌定植情况和组织病理变化。5.半定量RT-PCR检测SPF级Balb/c小鼠、C57BL/6小鼠和裸鼠胃粘膜的IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-10mRNA表达水平差异,初步探索其致病机制。结果:1.从2339例胃镜活检标本中检出7例H.heilmannii感染标本,总检出率为0.30%,与国外同期报道相符,但低于90年代检出率0.98%（P=0.0331）。2.703例急慢性胃病患者中筛选出1例女性患者,并取其胃粘膜在小鼠体内传代保存,在不同条件下进行培养尝试,目前未获成功。3.成功建立了BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠、裸鼠H.heilmannii长期定植的动物模型。三种小鼠的定植量随时间的延长都有增加的趋势,BALB/c小鼠有显著性差异（Mann-Whitney U秩和检验,P＜0.05）。随着周期延长,BALB/c小鼠的慢性炎症评分在8周时最高,随后下降,而后期再次增高（P=0.042）。而C57BL/6小鼠持续较高,各时间点没有显著差异（P=0.877）。裸鼠未见明显慢性炎症,但第4-12周全程维持着明显的中性粒细胞浸润（Mann-Whitney U秩和检验,P＞0.05）。BALB/c小鼠急性活动性炎症评分在12周最高,36周最低（Mann-Whitney U秩和检验,P＜0.05）:C57BL/6小鼠活动性炎症评分最低,但8周以后趋于平稳（Mann-Whitney U秩和检验,P＞0.05）。第24周后,实验组免疫健全小鼠开始出现轻度萎缩、肠化和淋巴滤泡的形成,到第36周83%的受染BALB/c小鼠出现淋巴滤泡,明显破坏粘膜肌层,甚至粘膜全层。对照组三种小鼠均未见明显感染和组织学改变。4.感染初期,免疫健全小鼠胃粘膜的IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-10mRNA均较对照组明显升高（P＜0.05）,IL-1β在第4周即达高峰,而IFN-γ、IL-4、IL-10在随后的第8至12周有最大表达。免疫健全小鼠的炎症因子表达趋势相似,但C57BL/6小鼠的IFN-γ表达量在12周后变化不大,而BALB/c小鼠明显下调,且第36周C57BL/6小鼠的IL-4低于对照组（P＜0.05）。裸鼠各细胞因子也较对照组稍有增高,除IL-1β、IL-4mRNA外（P＜0.05）,IFN-γ、IL-10组间相比均无显著性差异（P＞0.05）。BALB/c小鼠的慢性炎症程度与IL-1β、定植程度分别相关（rs=0.489,P=0.005;rs=0.446,P=0.012）,C57BL/6小鼠慢性胃炎程度与IFN-γ相关（rs=0.552,P=0.001）。结论:1.现阶段H.heilmannii在上消化道疾病中检出率较90年代降低,大规模抗生素的使用可能是其原因;检出病种多见于萎缩性胃炎,提示H.heilmannii是萎缩性胃炎的一种重要致病菌。2.成功建立了H.heilmannii BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠体内长期定植,为研究H.heilmannii的致病机制提供了研究模型。3.T淋巴细胞代表的细胞免疫在H.heilmannii感染中占主要地位,体液免疫也起到了一定作用。4.不同品系小鼠对H.heilmannii感染的免疫机制不同,C57BL/6小鼠对H.heilmannii感染呈Th1型免疫占优势,而BALB/c小鼠为Th1/Th2型混合免疫反应。