刺五加胚性细胞团形成差异表达基因的筛选及克隆

论文摘要

刺五加(Eleutherococcus senticosus Maxim)是珍贵的药用植物,由于不合理采摘,野生刺五加数量急剧减少,已被列入保护植物。对刺五加进行人工培育、扩繁,是满足人们需求的主要途径,而建立高效的刺五加体细胞发生体系则是实现这一目的最为有效的方法。体细胞胚发生是一个复杂的过程,应用分子生物学手段对这一发生机制进行研究是十分有必要的,这对更好地保护这一珍贵物种具有重要的现实意义。本文以刺五加的胚性细胞团和非胚性细胞团为材料,对以胚性细胞团方式产生的体细胞胚相关基因进行了研究。对前期做过的基因芯片结果进行归类分析,从中挑选差异倍数较显著且与体胚发生相关的基因进行定量PCR差异表达分析,结果表明,在选择的上调基因中,有一个基因在定量结果中表现为下调,其余的所有基因的表达差异结果均与芯片结果相同。通过同源性分析发现其余上调基因均与体细胞胚发生有直接或间接的相关性,由于工作量过大,所以首先选择了其中三个基因进行RACE克隆分析,并将它们分别命名为EsAP21、ESXET1、EsPT1。EsAP21基因全长为2033bp,编码549个氨基酸,同源性分析结果显示,该基因与拟南芥等物种PLT基因具有高度同源性,具有AP2/EREBP家族保守序列；EsXET1基因全长1102bp,编码290个氨基酸,多序列比对显示该基因编码的蛋白质与多物种的木葡聚糖内糖基转移酶具有高度同源性,属于糖基水解酶16家族；EsPT1基因全长1965bp,编码528个氨基酸,同源性比对结果显示该基因编码的蛋白与磷酸盐转运蛋白有很高的同源性,属于MFS超家族。结果表明,这三个基因分别在体细胞胚发生的不同时期上调表达,对细胞生长发育以及胚胎发生、细胞壁重建和磷酸盐的运输起重要的作用,推测在刺五加胚性细胞的发生及发育过程中这些基因协调表达,其中EsAP21基因起决定性作用。同时应用透射电子显微镜对1/3MS固体培养基培养的刺五加胚性细胞团和非胚性体细胞胚进行超微结构观察,对比结果表明胚性细胞具有丰富的细胞内含物,淀粉粒多,细胞壁厚,核质比大,这些生理特性为细胞分裂提供了必要的条件,也由此证明胚性细胞有较高的分裂活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 植物体细胞胚发生
• 1.2 刺五加体细胞胚发生研究
• 1.2.1 刺五加体细胞胚的发生方式的研究进展
• 1.2.2 刺五加体细胞胚相关生理生化研究
• 1.3 植物体细胞胚发生的相关基因研究进展
• 1.3.1 晚期胚胎丰富蛋白基因
• 1.3.2 AP2/EREBP基因
• 1.3.3 Leafy Cotyledon（LEC）基因
• 1.3.4 体细胞胚发生应答激酶
• 1.4 RACE克隆技术概述
• 1.4.1 RACE简述及其应用
• 1.4.2 SMART-RACE技术
• 1.5 研究目的与意义
• 1.6 研究技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料与试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 培养基的配制
• 2.1.3 RNA提取试剂
• 2.1.4 其他常用试剂
• 2.1.5 抗生素
• 2.1.6 菌种和克隆载体
• 2.1.7 实验用具及仪器
• 2.1.8 引物及测序
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基因芯片数据分析
• 2.2.2 RNA提取
• 2.2.3 RNA反转录
• 2.2.4 目的基因的PCR检测
• 2.2.5 目的基因的实时荧光定量PCR
• 2.2.6 目的基因的全长获得
• 2.2.7 超薄切片
• 3 结果与分析
• 3.1 基因芯片分析
• 3.2 目的基因的实时荧光定量PCR检测
• 3.2.1 挑选基因
• 3.2.2 总RNA提取
• 3.2.3 cDNA质量检测
• 3.2.4 RT-PCR检测引物
• 3.2.5 目的基因的定量PCR检测
• 3.3 目的基因全长克隆
• 3.3.1 cDNA片段比对
• 3.3.2 总RNA提取及cDNA第一链合成
• 3.3.3 EsAP21基因的克隆
• 3.3.4 EsXET1基因的克隆
• 3.3.5 EsPT1基因的RACE克隆及全长cDNA验证
• 3.4 生物信息学分析
• 3.4.1 EsAP21基因全长基因序列的生物信息学分析
• 3.4.2 EsXET1基因全长基因序列的生物信息学分析
• 3.4.3 EsPT1基因全长基因序列的生物信息学分析
• 3.5 透射电子显微镜细胞形态观察
• 4 讨论
• 4.1 刺五加RNA的提取条件优化
• 4.2 胚性细胞团相关基因的差异表达
• 4.3 透射电镜下的体胚细胞比较
• 4.4 需继续开展的研究
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢