利用外植体组织培养方法生产大豆异黄酮

论文摘要

针对目前我国异黄酮生产情况,探讨利用大豆不同外植体采用组织培养的方式,来提取大豆异黄酮,为今后生物反应器工厂化生产异黄酮是本研究的思路。针对栽培大豆,筛选最佳外植体和最佳愈伤组织培养基配方;通过对野生大豆的综合分析评定,筛选叶片异黄酮含量高的野生种。为外植体组织培养生产大豆异黄酮奠定前期工作基础。研究结果也初步表明,这种生产大豆异黄酮新思路是可行的。本研究的主要结果如下:(1)东农42大豆幼苗光照培养30d时,根中大豆苷元及染料木素含量分别是,相应培养时间无光照条件根中的3.69倍和3.59倍;在光照培养30d时真叶中大豆苷元和染料木素的含量仅次于根,此时是同时期无光照培养条件真叶中,大豆苷元和染料木素的含量的2倍。不同外植体培养得到的愈伤组织中,真叶的愈伤组织培养60d时大豆苷元及染料木素的含量最高,分别是真叶培养30d时的1.89倍和1.54倍,是培养90d时的4.56倍和4.17倍。光照培养的大豆幼苗中的,大豆苷元及染料木素含量高于愈伤组织中的含量。大豆苷元及染料木素总含量,较外植体中总含量增加最多的由真叶培养90d时外植体获得的愈伤组织,增加了162.53倍和111.71倍。结合不同外植体诱导出的愈伤组织的重量增长情况,在愈伤组织培养90d时,根、子叶节、子叶作为外植体培养愈伤组织,生产大豆苷元及染料木素的效果最好。合丰35在光照培养10、20、30d时根中的大豆苷元和染料木素的含量,分别是无光照培养的2.04倍和1.89倍、2.13倍和1.72倍、1.16倍和1.27倍。合丰35的大豆幼苗在光照培养20d时根中大豆苷元及染料木素的含量分别是,光照培养10d含量的1.48倍和1.35倍,在光照培养30d根中大豆苷元及染料木素含量分别是,光照培养10d含量的1.26倍和1.32倍。无论光照培养与否,合丰35在培养10d时子叶和子叶节中,大豆苷元及染料木素含量都比培养20d、30d子叶和子叶节中的含量高。(2)针刺无菌苗下胚轴和针刺子叶外植体被侵染的比例较高,比例分别是0.61倍和0.40倍。用端口涂液的方法更容易使下胚轴下部获得发根,大约有35条发根;在下胚轴中部端口涂抹发根农杆菌菌液的方法,获得的发根中大豆苷元和染料木素含量较高。用B5培养基培养的发根重量最高,是最低重量的2.4倍。无论用B5固体培养基还是用B5液体培养基都可以使发根中大豆苷元及染料木素的含量增加。但是发根中残留在B5液体培养基中大豆苷元及染料木素的浓度较高,分别是浓度最低的1/2MS液体培养基的12倍和11倍。(3)多年生野生大豆的生物学性状比较相似。多年生野生大豆叶片中大豆苷元及染料木素的含量高的均为Glycine tabacina种,分别是大豆苷元和染料木素含量最低的Glycine rabiginosa种的2.5倍和1.5倍。但是Glycine falcata种的大豆苷元和染料木素的含量比较高,Glycine falcata种具有叶片大、茎粗、叶柄粗等良好性状,可以作为高大豆苷元及染料木素含量的多年生野生大豆资源进行研究,并提供了可行的生产方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 大豆组织培养
• 1.2.2 大豆组织培养中激素的作用
• 1.2.3 农杆菌
• 1.2.4 大豆异黄酮的研究进展
• 1.2.5 多年生野生大豆的研究
• 1.3 研究内容
• 2. 材料与方法
• 2.1 供试大豆品种
• 2.2 试剂和仪器
• 2.3 调查项目与方法
• 2.4 组织培养和发根培养
• 2.4.1 大豆幼苗和外植体组织培养
• 2.4.2 发根培养
• 2.5 标准溶液的配置和标准曲线绘制
• 2.6 加样回收率
• 2.7 大豆苷元和染料木素的检测
• 2.8 样品的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 标准曲线和加样回收率
• 3.2 用组织培养方法生产大豆异黄酮的研究
• 3.2.1 光照大豆幼苗中大豆苷元及染料木素含量的影响
• 3.2.2 大豆不同外植体愈伤组织中大豆苷元和染料木素含量研究
• 3.3 发根农杆菌侵染大豆产生发根的研究
• 3.3.1 农杆菌侵染大豆无菌苗得到发根方法的优化
• 3.3.2 发根重量的分析
• 3.3.3 发根中大豆苷元和染料木素含量的分析
• 3.3.4 发根的培养及不同培养基中发根中大豆苷元和染料木素含量的比较
• 3.4 多年生野生大豆叶片中大豆异黄酮含量的测定及高异黄酮资源的筛选
• 3.4.1 多年生野生大豆的生物学性状调查及生长
• 3.4.2 多年生野生大豆叶片中大豆苷元的含量分析
• 3.4.3 多年生野生大豆叶片中染料木素含量分析
• 3.4.4 多年生野生大豆叶片中大豆苷元和染料木素总含量分析
• 3.4.5 多年生野生大豆生态特征与生产大豆异黄酮的综合利用
• 4 讨论
• 4.1 不同光照条件大豆幼苗不同部位中大豆苷元和染料木素的含量
• 4.2 大豆愈伤组织中大豆苷元和染料木素含量
• 4.3 发根农杆菌侵染大豆幼苗和外植体获得发根的培养
• 4.4 多年生野生大豆
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的论文