基于基因芯片对浸矿微生物群落结构及功能的定量化研究

论文摘要

我国矿产资源是以低品位多金属复杂原生硫化矿为主,传统选冶技术成本高,环境污染严重已经不能满足经济的需求,而微生物冶金通过利用以矿物为能源的微生物的作用,氧化分解矿物使金属离子进入溶液,进一步分离、提取金属具有成本低、流程短、设备简单、低污染等优势逐渐成为解决资源开发与环境保护矛盾的新途径。但生物冶金过程存在浸出速度慢、浸出周期长,对某些重金属缺乏抗性的问题,特别是对于复杂低品位的原生硫化矿而言,需要有高氧化活性的微生物才能破坏其晶格,而如何快速鉴别与筛选高效浸矿微生物成为解决生物冶金浸出速度慢、浸出率低这一难题的关键；另一方面,生物冶金过程的多样性也决定了浸矿体系微生物种群与功能及其影响因素的复杂性,有效的浸矿微生物在浸矿体系中没有高效表达。上述两个难点是制约微生物冶金技术发展的瓶颈,因此,如何强化细菌浸出成为生物冶金发展的重要课题,需要用更新、更有力的生物技术来研究浸矿微生物本身特性。嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）是目前研究得最多的浸矿细菌,在矿堆、浸矿系统中普遍存在,好氧嗜酸,可以将Fe2+氧化成Fe3+,将还原态的硫氧化成SO42-,是生物冶金中最常用的菌种,也是完成全基因组序列测定的唯一浸矿细菌,这样我们就可以在全基因组水平上对A. ferrooxidans进行全面系统的研究。本文首先基于TIGR公布的A. ferrooxidans ATCC 23270全部序列信息共选得3217个寡聚核苷酸探针,挑选人类基因和植物基因作为阴性对照或定量对照,并以A.f菌的基因组DNA作为阳性对照,设计了58mer寡核苷酸全基因组芯片,整个芯片包含3270个探针。我们还对此芯片进行了评估,此芯片的杂交最佳温度为45℃；检测灵敏度为5ng, 100ng时已经达到饱和,且信号值与浓度之间具有很强的线性关系（r2=0.992）,可以作为定量判定的依据；没有发现与非靶标基因间的非特异性交互杂交现象,表明此寡核苷酸芯片具有良好的特异性。利用构建的全基因组芯片对不同浸矿活性的菌株进行了基因层面的分析,在3217个基因中发现有967个基因为不同的菌株所特有,其余的2250个（70%）基因为所有A.f菌共有,可以作为是否是A.f菌的判据；另发现320个高氧化活性菌特征基因,在其中还找到135个与亚铁和硫氧化以及抗性等功能有关的基因,这些基因作为A.f菌冶金性能好坏的判据。据此建立了“嗜酸氧化亚铁硫杆菌及其活性的基因芯片检测方法”国家标准（GB/T20929-2007）。为了进一步了解有效的浸矿微生物在浸矿体系中高效表达的途径,本文基于我们已经克隆和测序获得的嗜酸性微生物序列和NCBI已知的相关序列设计了1194个50mer寡聚核苷酸探针,其中包括16S rRNA探针140个、功能基因探针1054个,这些功能基因探针的靶标序列分别涉及到碳固定,氮代谢,硫代谢,铁氧化,金属抗性、电子传递)和外膜蛋白相关的功能基因,人类基因在芯片中用来作为阴性对照和定量对照。此外,基因芯片上所涉及的这些靶标序列几乎包含目前在自然酸性环境和浸出系统中已知的27个属和55种嗜酸性细菌的全部基因序列,能够有效的分辨酸性生态系统中微生物群落结构和功能的差异性。本文还使用基于16S rRNA基因的RFLP技术研究了AMD微生物群落的地理分布,以及使用第二代功能基芯片研究了其微生物群落的系统发育和功能多样性、组成和结构；结果表明检测的不同的AMD样地其微生物群落无论在系统发育多样性、功能多样性还是组成和结构上都不同,周围的环境参数可能是造成这种现象主要的原因,尤其是Fe、S、Ca、Mg、Zn和Cu的浓度以及pH值是其最主要的影响因素；这项研究提供了有力的手段去了解酸性矿坑水的地理分布、多样性、组成、结构和功能同时对进一步发展生物冶金技术从废矿石和低品位矿石中回收有价金属离子提供有力的科学支撑。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 微生物浸矿
• 1.1.1 微生物浸矿的历史沿革
• 1.1.2 微生物浸矿机理
• 1.1.3 微生物浸矿体系中微生物的多样性
• 1.1.4 微生物浸矿的影响因素及难点
• 1.1.5 微生物种群结构和功能分析的分子生物学手段及其优缺点
• 1.2 基因芯片技术概述
• 1.2.1 基因芯片概念及基本原理
• 1.2.2 基因芯片的分类
• 1.2.3 直接点样法芯片的技术组成及流程
• 1.2.4 基因芯片在环境多样性研究中的应用
• 1.3 本论文的目的、意义及技术方案
• 1.3.1 本论文的研究目的和意义
• 1.3.2 本论文的研究思路、内容及技术方案
• 1.3.3 本论文课题资助情况
• 第二章 A.f ATCC 23270 58mer全基因组芯片的构建、评估
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要仪器设备
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要溶液的配置
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270的培养及菌体的收集
• 2.2.2 细菌基因组的提取及质量检测
• 2.2.3 探针的设计与合成
• 2.2.4 储备液和点样液的制备
• 2.2.5 芯片的构建及质量检测
• 2.2.6 基因组DNA荧光标记及标记产物的纯化
• 2.2.7 芯片杂交及洗涤
• 2.2.8 芯片扫描与数据分析
• 2.2.9 PCR引物设计及扩增
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 探针设计及合成
• 2.3.2 芯片构建
• 2.3.3 芯片评估
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 应用A.f ATCC 23270全基因组芯片鉴定和筛选高效浸矿微生物
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 实验菌株的来源、培养及收集
• 3.2.2 细菌基因组的提取及质量检测
• 3.2.3 菌株总RNA的提取
• 3.2.4 菌株总RNA的纯化
• 3.2.5 浸矿实验（摇瓶）
• 3.2.6 基因组DNA荧光标记及标记产物的纯化
• 3.2.7 RNA荧光标记及标记产物的纯化
• 3.2.8 芯片杂交及洗涤
• 3.2.9 芯片扫描与数据分析
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 浸矿实验结果
• 3.3.2 全基因组杂交结果—A.f菌判据
• 3.3.3 全基因组杂交结果—高活性A.f菌判据
• 3.3.4 判据验证
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 研究浸矿体系微生物群落结构与功能的50mer寡核苷酸功能基因芯片的构建
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 探针的设计与合成
• 4.2.2 储备液和点样液的制备
• 4.2.3 芯片的构建及质量检测
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 探针设计与合成
• 4.3.2 芯片构建
• 4.3.3 两代功能基因芯片的技术参数比较
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 应用功能基因芯片检测酸性矿坑水中微生物群落结构和功能
• 5.1 实验材料
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 样地描述和样品收集
• 5.2.2 地球化学参数分析
• 5.2.3 群落DNA的提取和纯化
• 5.2.4 16S rRNA基因的扩增和克隆
• 5.2.5 基因组DNA荧光标记及标记产物的纯化
• 5.2.6 芯片杂交及洗涤
• 5.2.7 芯片扫描与数据分析
• 5.2.8 数据统计及分析
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 样点的地球化学特征
• 5.3.2 AMD微生物群落的地理分布
• 5.3.3 AMD微生物群落多样性、结构和功能概述
• 5.3.4 16S rRNA和功能基因的聚类分析
• 5.3.5 系统发育多样性及系统发育微生物群落结构与地球化学特性的关系
• 5.3.6 功能多样性及功能微生物群落结构与地球化学特性的关系
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果