KLF4对内毒素所致IL-6基因表达的调控及机制研究

论文摘要

脓毒症（sepsis）是由感染引起的全身炎症反应综合征（systemic inflammatoryresponse syndrome,SIRS）。虽然其发生机制尚未完全明确,但是革兰氏阴性细菌胞壁上的脂多糖（LPS）启动体内免疫系统在脓毒症发病中的重要性已经受到广泛关注。LPS进入体内可以激活多条信号通路,直接或间接激活炎症相关转录因子,可以导致大量下游炎症介质基因的过度表达或抑制表达。IL-6是一种重要的炎症介质,在LPS刺激下可以过度表达。LPS与Toll样受体、CD14和MD-2组成的复合物结合,然后激活NF-κB信号转导通路。活化的NF-κB进入核内,激活IL-6的表达。Kruppel样因子4（Kruppel-like factor 4 or Gut Kruppel-like factor,KLF4/GKLF）是Sp/Kruppel样锌指转录因子家族的成员之一。KLF4能够与下游基因启动子区的GC盒,CACCC盒和基础转录元件等三种结合元件相结合,从而直接调控这些基因的表达。KLF4通过这种调控作用在表皮增殖分化、抑制结肠癌、膀胱癌等恶性肿瘤发生发展中发挥重要作用。本实验室采用cDNA微阵列检测了内毒素休克小鼠肺组织基因表达谱的变化,发现KLF4基因在注射内毒素2小时的小鼠肺组织中表达上调;注射内毒素20小时后,KLF4基因的表达水平进一步增高,达正常水平的10倍以上。研究发现在巨噬细胞中,KLF4能够被IFN-γ、LPS或TNF-α诱导表达;能够通过靶基因启动子区KLF4结合元件以及与NF-κB家族成员p65的相互作用共同诱导iNOS（inducible nitric-oxidesynthase,iNOS）的表达,并通过与smad3的辅助激活子p300的相互作用而抑制smad3应答基因如PAI-I（plasminogen activator inhibitor type-Ⅰ,PAI-Ⅰ）的表达,从而发挥其促炎因子的功能。最近研究表明KLF4可以调节血管内皮细胞的炎症反应,并且在凝血过程中也有重要作用。本实验室证明KLF4在LPS诱导的巨噬细胞的炎症反应中可以直接调控IL-1β、IL-10和后期炎症介质HMGB-1的表达。这些研究表明KLF4在炎症中具有重要作用。本实验采用KLF4过表达的RAW264.7细胞株,并采用反义寡核苷酸技术建立了内源性KLF4表达抑制的模型。根据生物信息学对炎症介质基因启动子区的分析以及本实验室的工作基础,选取IL-6作为研究对象,观察KLF4对IL-6的基因表达以及释放的影响,并对其调控机制做了初步探讨,获得以下实验结果:（1）LPS可以诱导RAW264.7巨噬细胞KLF4的表达和IL-6的释放（2）KLF4对LPS刺激下IL-6的mRNA水平表达的影响。正常状态下,RAW264.7细胞的IL-6mRNA水平表达很低;LPS刺激后,IL-6的mRNA表达明显升高,而KLF4过表达明显抑制IL-6的mRNA的表达。（3）KLF4对LPS刺激下IL-6的蛋白质水平表达的影响。KLF4过表达可以抑制LPS诱导的IL-6的释放:而KLF4内源性抑制则使这种作用消失。（4）KLF4对IL-6的表达的影响并不是通过与IL-6启动子区的KLF4结合原件直接结合而调控。（5）KLF4对LPS刺激下IL-6的基因启动子转录活性的影响。KLF4可以抑制LPS所致的IL-6基因启动子的转录活性。上述结果表明,KLF4通过抑制IL-6的表达与释放可能在LPS所致的SIRS中有重要作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 技术路线
• 材料与方法
• 1.材料
• 1.1 主要材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 引物及寡核苷酸序列
• 2.方法
• 2.1 细胞培养及处理
• 2.2 组织和细胞总RNA的提取
• 2.3 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
• 2.4 酶联免疫吸附实验（ELISA）
• 2.5 生物信息学数据分析
• 2.6 质粒构建
• 2.7 脂质体转染
• 2.8 细胞核蛋白的提取
• 2.9 凝胶电泳迁移率分析（EMSA）
• 2.10 荧光素酶报告基因分析
• 2.11 免疫印迹分析（Western blot）
• 2.12 统计学处理
• 实验结果
• 1.LPS处理不同时间对小鼠RAW264.7巨噬细胞KLF4蛋白表达的影响
• 2.LPS处理不同时间对小鼠RAW264.7巨噬细胞11,-6蛋白释放的影响
• 3.KLF4过表达对IL-6mRNA表达的影响
• 4.KLF4过表达对IL-6蛋白表达的影响
• 5.采用反义寡核苷酸技术使KLF4表达减少，然后检测IL-6的表达
• 6.采用EMSA检测细胞中KLF4与IL-6基因启动子区KLF4元件的结合
• 7.KLF4对IL-6基因启动子转录活性的影响
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢