论文摘要
背景纤溶系统不仅参与纤维蛋白溶解，而且对细胞粘附、增殖、迁移、基质破坏、不稳定斑块的形成和破裂以及动脉瘤的形成等均起到了关键作用。在动脉粥样硬化病程中，纤溶系统与冠心病严重并发症如急性心肌梗死和急性再闭塞密切相关，实际上它与动脉粥样硬化的整个过程都不可分割，其主要成分包括纤溶酶原及纤溶酶，后者是多种重要的生理病理过程，如细胞迁移、组织重构和肿瘤细胞转移的关键蛋白酶。纤溶酶原的激活需要纤溶酶原激活物，分为组织型（tPA）和尿激酶型（uPA）两种。目前认为tPA激活纤溶酶原后可以溶解循环中纤维蛋白；uPA与其细胞受体（uPAR）结合后激活纤溶酶原，可以将蛋白酶解限制在细胞周围。uPAR位于多种细胞表面，近年对uPAR的研究多集中在肿瘤转移方面，认为uPA和uPAR的高表达与肿瘤的远处转移正相关，是预后的重要指标。并非偶然的是，有人对动脉粥样硬化斑块中的uPA和uPAR表达进行了检测，发现粥样硬化斑块中两者都高表达。目的本研究旨在明确人单核／巨噬细胞表达uPAR的促动脉粥样硬化作用：首先在临床水平，检测uPAR在冠心病高危患者外周血单核细胞上是否已经高表达，分析其表达水平与冠心病危险因素分层的相关性。同时在体外细胞水平，探讨粥样硬化过程中的炎症因子如γ干扰素（INF-γ）、氧化低密度脂蛋白（oxLDL）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）对巨噬细胞生成uPAR的影响，并且了解阿托伐他汀对这些因子的干预作用。在细胞功能水平，通过Transwell和细胞分选方法，将uPA、uPA抗体、纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）、抗uPAR等因子与单核细胞共同孵育，探讨uPA和uPAR在单核细胞趋化过程中的作用及机制。最后在人粥样斑块的组织水平，检测斑块中uPAR表达的情况，以及在不同病变部位表达的差异。方法与结果1、收集临床上稳定和不稳定冠心病、初发糖尿病以及具有不同冠心病危险因素的病人，检测血浆中tPA，uPA，PAI-1等纤溶相关指标的水平；应用流式细胞仪测量外周血单核细胞上uPAR表达的比例，结果显示：初发糖尿病患者处于高凝和纤溶亢进状态；稳定冠心病患者和ACS患者纤溶活性均明显下降，以ACS患者最为严重。初发糖尿病、ACS和代谢综合征患者外周血单核细胞上uPAR表达确实已经显著升高，这种升高受到代谢异常的调节，尤其是高脂血症能显著增加单核细胞表达uPAR。血脂和血糖异常同时存在可能是一对影响uPAR表达的关键因素。2、表达uPAR的单核细胞在相差显微镜下表现为颗粒感和立体感明显增强，细胞周围有光晕，与不表达uPAR的细胞明显不同，而且这种形态学的改变和uPAR的表达呈一一对应关系。3、本研究采用密度梯度离心和粘附法分离、纯化单核细胞，用细胞原位ELISA法检测uPAR抗原，底物发色法检测uPA活性和RT-PCR检测uPAR mRNA水平。我们发现在体外实验中，巨噬细胞粘附和分化本身可以诱导产生uPA，但不诱导uPAR。INF-γ和MCP-1对于巨噬细胞产生uPA的活性是一种抑制作用，而高浓度oxLDL则是刺激作用。INF-γ、MCP-1和oxLDL三种因素对巨噬细胞生成uPAR的影响是不同的：INF-γ抑制uPAR表达，oxLDL和MCP-1能够增强uPAR的表达，oxLDL是慢刺激，MCP-1则是快刺激。中浓度和高浓度oxLDL刺激巨噬细胞表达uPAR的效应可以被阿托伐他汀显著抑制，这是通过降低mRNA水平实现的。4、利用流式细胞分选的方法，将外周血单核细胞分选为uPAR阳性和uPAR阴性两组，给予uPA抗体、uPAR抗体、uPA和PAI-1等因子作用观测单核细胞迁移情况：PAI-1和抗uPA抗体对单核细胞迁移的影响不大，而uPA的氨基末端（ATF）则显著抑制单核细胞的迁移，说明uPA与uPAR结合后的相互作用在迁移中起关键作用。随着抗uPAR抗体浓度的递增，单核细胞的迁移呈递减。ATF对于uPAR的阻断作用强于抗uPAR抗体，对细胞迁移的抑制作用也更明显。5、从临床上收集动脉粥样硬化斑块剥脱标本，通过免疫组化等方法，观察uPAR在斑块中的表达部位；与巨噬细胞、平滑肌细胞的关系以及半定量检测斑块不同部位uPAR表达量的差异。研究结果显示，uPAR在正常乳内动脉的内膜和中膜无表达；而在动脉粥样硬化斑块的内膜中uPAR广泛表达，与巨噬细胞和平滑肌细胞分布的部位一致；uPAR在脂质池附近表达量最高，在斑块肩部和破裂斑块的部位也有大量表达，呈团块状。斑块内膜处uPAR的表达比中膜处显著升高。结论本研究证实动脉粥样斑块中uPAR大量表达，而且首次发现在冠心病高危因素的患者外周血单核细胞上uPAR的表达就已经显著增高，这种升高和代谢异常明确相关，就将uPAR在致粥样硬化中的作用追溯到了粥样硬化形成的早期，并为临床利用uPAR来评价冠心病稳定性、干预uPAR表达或功能来治疗和预防冠心病提供了一个可能的方向。本研究还探讨了体外INF-γ、MCP-1和oxLDL对巨噬细胞表达uPAR的影响和特点；发现阿托伐他汀可以抑制oxLDL对巨噬细胞表达uPAR的刺激作用，这是通过转录水平来实现的，这些结果为进一步深入研究uPAR在粥样硬化形成中的作用和机制打下了基础。
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