论文摘要
胰蛋白酶是消化酶的一种,属于丝氨酸蛋白酶家族,对鱼类食物蛋白质的消化具有重要的生理作用。胰蛋白酶来源于鱼类的胰脏、肠道和幽门盲囊。胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于鱼类胰脏中,被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活,分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。鱼类胰蛋白酶的相关研究可为人工配合饵料提供相关信息,也可为一直作为下脚料的鱼类内脏的合理回收利用提供理论基础。可是到目前为止,还未见鲫鱼和黄鳝胰蛋白酶纯化、性质及蛋白分解活性的比较方面的研究报道。本研究主要是对鲫鱼和黄鳝胰蛋白酶进行分离纯化,并对其性质和蛋白分解活性进行了比较分析,具体研究如下:1.鲫鱼和黄鳝胰蛋白酶的纯化将鲫鱼和黄鳝解剖取出肝胰脏,用预冷双蒸水淋洗,沥干后加入四倍体积的Tris-HCl缓冲液,搅碎过夜提取,离心取上清液,在24h内测完粗胰酶活性。粗提液用30-70%硫酸铵分级沉淀,离心收集沉淀溶解得粗酶液,透析过夜。透析后的提取液先用HiTrap Benzamidine FF（high sub）亲和预装柱纯化,用pH3.0的甘氨酸-HCl洗脱,收集具有胰蛋白酶活性的洗脱峰进行离子交换,离子交换填料采用Amersham公司的DEAE-SepharoseTM Fast Flow（1.2×20cm）,用含0-0.5M NaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱,收集具有胰蛋白酶活性的洗脱峰。用考马斯亮兰蛋白测定试剂盒测定各步收集组分的蛋白质含量,以TAME为底物,测定各步收集组分的胰蛋白酶活性,计算产率和纯化倍数来确定各阶段的纯化效果,测得鲫鱼和黄鳝胰蛋白酶的最终的产率分别为14.1%和17.6%,纯化倍数分别达到了约821倍和775倍。2.鲫鱼和黄鳝胰蛋白酶性质的比较研究用5%的浓缩胶和12%的分离胶进行SDS-PAGE电泳,最终纯化得到的鲫鱼和黄鳝胰蛋白酶均呈现出单一条带。并测得鲫鱼和黄鳝胰蛋白酶的分子量分别为25.4KDa和26.8KDa。以BANPA为底物,测得鲫鱼胰蛋白酶的动力学常数（Km）为0.035mM,黄鳝胰蛋白酶的动力学常数（Km）为0.023mM。设定不同的温度和pH值,以TAME为底物测得鲫鱼和黄鳝胰蛋白酶的最适反应温度均为55℃,最适反应pH分别为8.5和8.0,而且这两种胰蛋白酶在500C以下活性较稳定,鲫鱼胰蛋白酶在pH5.0-10.0范围内较稳定,而黄鳝胰蛋白酶在pH6.0-9.0范围内稳定性较高,两种胰蛋白酶在酸性条件下活性丧失得很快极不稳定。取纯化后的鲫鱼和黄鳝胰蛋白酶,分别加入不同浓度的金属离子和抑制剂处理30min后,以TAME为底物测定剩余酶活性进行比较,得到Na+、Ca2+对两种胰蛋白酶的活性并无明显影响,Mg2+对两种胰蛋白酶的活性有轻微的抑制作用,Cu2+对两种胰蛋白酶的活性有强烈的抑制作用,K+对两种胰蛋白酶的活性影响均是先激活后抑制;β-巯基乙醇和EDTA钠对两种胰蛋白酶活性的抑制作用较弱, PMSF和苯甲脒对两种胰蛋白酶活性均有较强的抑制作用。3.鲫鱼和黄鳝胰蛋白酶蛋白分解活性的比较研究在离体条件下测定并比较了两种纯化的胰蛋白酶对酪蛋白、牛血清白蛋白、水解乳蛋白、豆粕、菜粕、棉粕和鱼粉的离体消化率和对蛋白质的酶解动力学。这两种胰蛋白酶对这7种蛋白的酶解速度和消化能力均差异显著（P<0.05）,其中豆粕、菜粕、棉粕和鱼粉四种饲料蛋白原料中鲫鱼胰蛋白酶对棉粕的消化能力较强,黄鳝胰蛋白酶对鱼粉的消化能力较强,而且鲫鱼胰蛋白酶的活性要高于黄鳝胰蛋白酶。