nm23-M2表达载体构建及其在小鼠胚胎着床和早期发育中的作用研究

论文摘要

目的: 本实验通过构建 nm23-M2 原核表达质粒,表达并提纯重组蛋白,制备其抗体,为进一步研究 nm23-M2 基因的功能和蛋白的作用奠定基础。并从基因和蛋白水平研究 nm23-M2 在小鼠胚胎着床和发育早期子宫内膜中的表达、分布规律及动态变化,探讨其作用机理,为探索人类胚胎着床和早期发育机制提供实验基础和理论依据。 方法: 1. RT-PCR 法扩增 nm23-M2 基因,经限制性内切酶酶切后克隆入原核表达载体 pQE30 中,构建原核表达质粒并进行酶切和 DNA 双向测序鉴定。 2. 将重组质粒在大肠杆菌中表达,用 SDS-PAGE 和免疫印迹鉴定,亲和层析法纯化。纯化的重组蛋白免疫新西兰兔,免疫全过程结束后两周,处死动物,收集血清,琼脂双向扩散法检测抗血清效价。当抗体效价达到 1:64 时,处死兔,收集血清。抗血清经亲和层析纯化,免疫印迹鉴定,免疫组化比较它与抗 nm23-H2 抗体在检测未孕小鼠子宫内膜 nm23-M2 蛋白表达的灵敏性。 3. 建立小鼠妊娠 4,6,8,10 天（以 D4、D6、D8、D10 表示）的动物模型,D6、D8、D10 组又分为着床旁和着床点组（以 D6a、D8a、D10a 和 D6b、D8b、D10b 表示）。分别取未妊娠组和 D4 组小鼠子宫内膜组织以及 D6、D8、D10 小鼠子宫内膜着床旁和着床点组织。重庆医科大学硕士研究生学位论文4RT-PCR 法检测 nm23-M2 mRNA 的表达量;免疫组织化学法检测nm23-M2 蛋白的表达和分布情况。 结果:1. RT-PCR 扩增片段大小与预期值（459bp）相同,构建的重组质粒pQE30 /nm23-M2 经限制性内切酶酶切鉴定,DNA 双向测序证实其序列与 nm23-M2 序列一致。2. 重组质粒在大肠杆菌中高效表达,产物经 SDS-PAGE 和免疫印迹方法鉴定为 17KD 的 nm23-M2 蛋白,目的蛋白含量占菌体总蛋白含量的 45%以上,经纯化后得到纯度为 97%以上的 nm23-M2 蛋白。该蛋白成功免疫新西兰兔,琼脂双向扩散实验测得所获血清效价为1?64。血清纯化后得到纯度为 90%以上,浓度为 13.6mg/ml 的抗体,经免疫印迹鉴定为抗 nm23-M2 抗体。免疫组化结果显示,抗nm23-M2 抗体检测未妊娠小鼠子宫内膜 nm23-M2 蛋白表达的灵敏性高于抗 nm23-H2 抗体（P<0.01）。3. RT-PCR 结果表明:未妊娠与妊娠小鼠子宫内膜都有 nm23-M2 基因的表达;各妊娠组明显高于未妊娠组（P<0.05）;各妊娠组间比较差别有显著意义,呈递增趋势（P<0.01）;同一妊娠时间着床点表达显著高于着床旁（P<0.01）。4. 免疫组织化学结果表明:未妊娠与妊娠小鼠子宫内膜都有 nm23-M2蛋白表达,妊娠组显著高于未妊娠组（P<0.01）;各妊娠组间比较有显著性差异（P<0.01）,呈递增趋势;同一妊娠时间着床点表达明显高于着床旁（P<0.01）。其分布特点为胞浆型和/或核浆型,多呈区域性分布。腺上皮、腺腔呈高表达,以胞浆分布较多,胞核也可见。腺上皮细胞、腔上皮细胞和基质细胞胞浆内均可见棕黄色颗粒沉着,上皮细胞染色强度大于基质。呈距离梯度分布,越靠近

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分： NM23-M2 基因的扩增、原核质粒构建及鉴定
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分： NM23-M2 基因在大肠杆菌中的表达、重组蛋白的纯化及其抗体的制备
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分： NM23-M2 在小鼠胚胎着床和发育早期中子宫内膜的表达规律及作用研究
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 文献综述：NM23 基因在胚胎发育中的作用
• 致谢
• 攻读学位期间撰写的论文