柿子单宁体内外抗氧化活性及结构研究

论文摘要

本文以柿子为原料,选择了适于分离纯化柿子单宁的大孔树脂；比较了不同聚合度柿子单宁的体内外抗氧化活性：研究了柿子单宁（柿子单宁）对D-半乳糖（D-gal）诱导的氧化损伤的保护作用；探索了柿子单宁在体外体系中对低密度脂蛋白（LDL）氧化损伤的保护作用：对柿子单宁的结构特征进行了研究。研究结果如下：1分离纯化柿子单宁的大孔树脂的选择。为了选择对柿子单宁纯化性能较好的树脂,对五种大孔树脂进行了吸附与解吸实验。通过静态、动态吸附试验,比较了五种树脂对柿子单宁的吸附量、吸附率、解吸率、使用次数等指标。结果表明,B型树脂对柿子单宁具有吸附量大、易解吸、重复使用次数多、脱糖效果好等特点,是分离柿子单宁较理想的吸附树脂。2不同聚合度柿子单宁级分及柿子单宁的体外抗氧化作用。主要采用还原能力、清除羟基自由基能力、清除DPPH·及ABTS+·自由基的能力,以及对小鼠体外脂质过氧化的抑制作用等方法对柿子单宁级分的抗氧化效果进行了综合评价。结果显示,三个级分及柿子单宁在体外的各体系中均有很好的抗氧化效果,对体外脂质过氧化有很好的抑制作用,且其抗氧化效果随着聚合度增加而增强。3柿子单宁及级分Ⅲ对溴苯诱导的急性氧化损伤的保护作用。溴苯模型的动物实验结果表明,柿子单宁及聚合度高达33.6的级分Ⅲ在体内可以防止由溴苯引发的血清及肝匀浆超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性的下降（P<0.01）及丙二醛水平的上升（P<0.01）。两者均有很好的抗氧化效果,其效果不逊于低聚体含量大于70%的葡萄籽原花青素。但总体而言,柿子单宁的抗氧化效果优于级分Ⅲ。4柿子单宁对D-gal诱导的衰老小鼠的认知障碍及氧化损伤的保护作用。实验小鼠被分为六组,皮下注射D-gal或生理盐水六周,剂量为150 mg/kg;从第三周开始同时灌胃不同剂量的柿子单宁。六周试验完成后,通过矿场试验及水迷宫来观察小鼠的行为学,通过海马组织及皮肤组织切片来研究细胞形态,同时检测抗氧化酶（如SOD, CAT）的活性,非酶抗氧化剂（T-AOC, GSH等）的水平及脂质过氧化产物（MDA）的生成量。结果显示,柿子单宁能部分改善由D-半乳糖引起的意识损伤,防止海马组织损伤,提高抗氧化能力,可能成为治疗衰老相关疾病的一种新的手段。5柿子单宁在体外对LDL氧化的保护作用。在LDL的氧化修饰体系中加入柿子单宁后,可以显著延缓共轭二烯的形成、维持LDL的构象稳定、抑制脂质过氧化产物的生成等。因此,柿子单宁在体外对LDL的氧化修饰具有很好的保护作用。6柿子单宁的结构分析。对柿子单宁的结构研究表明,柿子单宁有着不同于其它水果单宁的独特结构特点：①末端构成：Catechin （C）, epigallocatechin-3-O-gallate （EGCG）及杨梅素（myricetin）,延伸端结构为epicatechin （EC）, epigallocatechin （EGC）, EGCG, epicatechin-3-O-gallate （ECG）,较其它来源的缩合单宁具有更大的异质性,特别是含有一罕见的杨梅素末端；②柿子单宁原翠雀定（prodelphinidin）结构含量高达65%,其酰基化程度达72%；③除含B-型连接外还含有A-型连接。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 前言
• 1 氧自由基
• 1.1 氧自由基的产生
• 1.2 氧自由基与脂质过氧化
• 1.3 氧自由基与衰老
• 1.3.1 衰老的理论与学说
• 1.3.1.1 程序类理论
• 1.3.1.2 损害或错误类理论
• 1.3.2 衰老的自由基理论
• 1.4 氧自由基与动脉粥样硬化
• 1.5 氧化损伤模型
• 2 抗氧化剂
• 2.1 合成抗氧化剂
• 2.2 天然抗氧化剂
• 3 柿子单宁的生理活性
• 3.1 柿子单宁的抗氧化性
• 3.2 柿子单宁的其它活性
• 4 本研究目的意义及内容
• 4.1 目的意义
• 4.2 研究内容
• 第二章 大孔树脂对柿子单宁的吸附与解吸特性的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料和仪器设备
• 1.1.1 试验原料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 仪器及设备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 柿子单宁的提取方法
• 1.2.2 柿子单宁标准曲线绘制
• 1.2.3 大孔树脂静态吸附量、吸附率及解吸率的测定
• 1.2.4 大孔树脂静态吸附动力学研究
• 1.2.5 动态吸附实验
• 1.2.6 重复使用次数
• 1.2.7 不同大孔树脂脱糖率的比较
• 1.2.7.1 多糖的标准曲线
• 1.2.7.2 脱糖率的比较
• 2 结果与分析
• 2.1 柿子单宁的标准曲线
• 2.2 五种大孔树脂对柿子单宁静态吸附及解吸性能比较
• 2.3 5种大孔树脂的静态吸附动力学曲线及吸附速率常数
• 2.4 动态吸附试验
• 2.4.1 使用次数
• 2.4.2 不同大孔树脂脱糖率的比较
• 3 小结
• 第三章 柿子单宁及其不同聚合度级分的体外抗氧化作用研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料和仪器设备
• 1.1.1 试验原料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 仪器及设备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 柿子单宁的提取方法
• 1.2.2 还原能力的测定
• 1.2.3 清除羟基自由基能力的测定
• 1.2.4 清除DPPH·自由基能力的测定
• 1.2.5 清除ABTS+·自由基能力的测定
• 1.2.6 对肝匀浆中脂质过氧化的抑制作用
• 1.2.6.1 肝匀浆的制备
• 1.2.6.2 对鼠肝匀浆自发性脂质过氧化的影响
• 1.2.6.3 对过氧化氢诱发的脂质过氧化的影响
• 1.2.6.4 对亚铁离子诱发的脂质过氧化的影响
• 1.2.7 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 体外抗氧化实验
• 2.1.1 还原能力的测定
• 2.1.2 清除羟基自由基能力的测定
• 2.1.3 清除DPPH·能力的测定
• 2.1.4 清除ABTS+·能力的测定
• 2.1.5 半数清除率
• 2.2 对体外肝匀浆中脂质过氧化的抑制
• 2.2.1 对肝组织自发性脂质过氧化的影响
• 2.2.2 对过氧化氢诱导的脂质过氧化的影响
• 2.2.3 对硫酸亚铁/Vc诱导的脂质过氧化的影响
• 3 小结
• 第四章 柿子单宁及级分Ⅲ在体内对溴苯氧化损伤的保护作用研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料和仪器设备
• 1.1.1 试验原料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 仪器及设备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 柿子单宁样品
• 1.2.2 实验动物的分组
• 1.2.3 溴苯模型的建立
• 1.2.4 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的测定
• 1.2.5 超氧化物歧化酶（SOD）的测定
• 1.2.6 丙二醛（MDA）含量的测定
• 1.2.7 蛋白质含量的测定
• 1.2.8 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 GSH-Px的酶活性
• 2.2 SOD的酶活性
• 2.3 肝匀浆中MDA的含量
• 3 小结
• 第五章 柿子单宁对D-半乳糖诱导的衰老小鼠的意识损伤及氧化损伤的改善作用
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料和仪器设备
• 1.1.1 试验原料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 仪器及设备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 柿子单宁的提取方法
• 1.2.2 实验动物分组
• 1.2.3 行为学测试
• 1.2.3.1 矿场试验
• 1.2.3.2 水迷宫
• 1.2.4 抗氧化指标的测定
• 1.2.4.1 超氧化物歧化酶（SOD）的测定
• 1.2.4.2 过氧化氢酶（CAT）的测定
• 1.2.4.3 乙酰胆碱酯酶（TChE）的测定
• 1.2.4.4 单胺氧化酶（MAO）的测定
• 1.2.4.5 总抗氧化能力（T-AOC）的测定
• 1.2.4.6 谷胱甘肽（GSH）的测定
• 1.2.4.7 丙二醛（MDA）含量的测定
• 1.2.4.8 羟脯氨酸（Hyp）的测定
• 1.2.4.9 蛋白质含量的测定
• 1.2.5 海马组织及皮肤组织的细胞形态
• 1.2.6 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 柿子单宁对D-GAL诱导的衰老小鼠的行为学的影响研究
• 2.1.1 矿场试验
• 2.1.2 水迷宫
• 2.2 柿子单宁对D-GAL诱导的衰老小鼠的海马组织中神经细胞形态的影响
• 2.3 柿子单宁对D-gal诱导的衰老小鼠的抗氧化指标的影响
• 2.3.1 柿子单宁对D-gal诱导的衰老小鼠血清中SOD活性及GSH水平的影响
• 2.3.2 柿子单宁对D-gal诱导的衰老小鼠脑组织中TChE、MAO、T-AOC活性及GSH、MDA水平的影响
• 2.3.3 柿子单宁对D-gal诱导的衰老小鼠肝组织中CAT、T-AOC活性及GSH、MDA水平的影响
• 2.4 柿子单宁对D-GAL诱导的衰老小鼠的皮肤组织细胞形态及羟脯氨酸（HYP）含量的影响
• 3 小结
• 2+诱导的LDL氧化损伤的保护作用'>第六章 柿子单宁在体外对CU²⁺诱导的LDL氧化损伤的保护作用
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料和仪器设备
• 1.1.1 试验原料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 仪器及设备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 柿子单宁的制备
• 1.2.2 ox-LDL的制备
• 1.2.3 共轭二烯（conjugated diene,CD）的形成
• 1.2.3.1 实验样品的处理
• 1.2.3.2 共轭二烯形成的测定
• 1.2.4 紫外吸收光谱的测定
• 1.2.5 脂质过氧化产物MDA的测定
• 1.2.6 褐脂质的测定
• 1.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2 结果与分析
• 2.1 共轭二烯的形成
• 2.1.1 A234 nm吸光度的测定
• 2.1.2 柿子单宁对共轭二烯形成的抑制作用
• 2.2 紫外吸收光谱
• 2.3 脂质过氧化产物的测定
• 2.3.1 MDA的生成
• 2.3.2 褐脂质的测定
• 2.4 SDS-PAGE电泳
• 3 小结
• 第七章 柿子单宁的结构分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料和仪器设备
• 1.1.1 试验原料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 仪器及设备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 柿子单宁的提取方法
• 1.2.2 MALDI-TOF MS
• 1.2.3 硫解
• 1.2.4 高效液相色谱电喷雾质谱（HPLC-ESI-MS）
• 1.2.5 GPC
• 13C NMR'>1.2.6¹3C NMR
• 2 结果与分析
• 2.1 MALDI-TOF MS
• 2.2 硫解-HPLC
• 13C-NMR'>2.3¹3C-NMR
• 3 小结
• 第八章 结论与展望
• 1 结论
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录