论文摘要
第一部分脑缺血再灌注大鼠大脑皮质Nogo-A、NgR基因表达及Nogo-A反义寡核苷酸的作用1、脑缺血再灌注大鼠Nogo-A及其受体NgRmRNA和蛋白表达的变化目的探讨脑缺血再灌注后大鼠缺血中心区及周围区大脑皮质髓鞘相关的抑制分子Nogo-A及其受体NgR的mRNA和蛋白表达的变化规律及意义。方法采用线栓法制作大鼠脑缺血再灌注模型,分为假手术对照组、缺血2h再灌注6h、12h、24h、48h、72h、7d和14d组,通过HE染色进行病理观察,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法检测mRNA、免疫组织化学的方法检测蛋白表达,观察脑缺血再灌注后缺血中心区及周围区大脑皮质Nogo-A及其受体NgR的变化。结果Nogo-AmRNA及蛋白表达在缺血中心区6h即有下降（与对照组相比p<0.05）,并随缺血时间延长表达逐渐减少,24h降至最低并持续至14d（p<0.01）;而缺血周边区,再灌注48h前无显著性变化,72h表达增加（P<0.05）,7d表达最强（P<0.01）,14d降至正常。NgR mRNA及蛋白表达在6h缺血中心区开始下降（p<0.05）,48h降至最低（P<0.01）,而缺血周围区NgR mRNA及蛋白表达在各个时间点无显著变化（P>0.05）。结论脑缺血后灶周Nogo-A mRNA及蛋白表达增加持续至再灌注后7d以上,针对其表达的规律进行干预可能成为脑梗死后改善轴突生长的有效措施;灶周NgR的表达无显著变化,显示Nogo-A的作用尚有其他受体介导。2、脑室注射反义寡核苷酸对大鼠Nogo-A mRNA及蛋白表达的影响目的研究侧脑室注射Nogo-A反义寡核苷酸对大鼠大脑皮质Nogo-AmRNA及其蛋白表达的影响。方法成年Wistar大鼠53只,分为A组（正常对照组）、B组及C组,后两组分别经侧脑室注射随机序列寡核苷酸及Nogo-A反义寡核苷酸。在注射后12h、24h、48h及72h用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫组织化学的方法分别检测大脑皮质Nogo-A mRNA及蛋白表达的变化。结果Nogo-A mRNA及蛋白表达在脑室注射Nogo-A反义寡核苷酸后12h开始下降,24h降至最低,48h开始回升,72h恢复正常。结论脑室注射Nogo-A反义寡核苷酸能抑制Nogo-A mRNA及蛋白的表达,可能成为中枢神经损伤后再生的新措施。第二部分Nogo-A反义寡核苷酸对脑缺血再灌注大鼠PKC-RhoA信号通路的影响目的研究大鼠脑缺血再灌注后PKC及RhoA基因表达的变化以及侧脑室注射Nogo-A反义寡核苷酸对PKC-RhoA信号通路的影响。方法成年Wistar大鼠40只,分为假手术对照组、缺血2h再灌注6h、24h、72h、1w和2w组,缺血2h脑室注射Nogo-A反义寡核苷酸再灌注72h、1w组,共8组。分别用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫印迹法（Western blot）检测缺血周围区大脑皮质PKCγ、RhoA的mRNA及蛋白表达的变化。结果对照组PKCγ及RhoA mRNA表达的A值分别为0.768±0.067和0.852±0.045,在缺血再灌注6h表达明显增加（1.030±0.072,1.10±0.087,p<0.01）24h降至正常（p>0.05）,72h再次升高（1.080±0.089,1.25±0.091）,PKCγ1w表达最强（1.216±0.094,p<0.01）,而RhoA mRNA 1w表达与3d无差异,2w二者都降至正常水平。脑室注射Nogo-A反义寡核苷酸后72h（0.870±0.091,0.947±0.085,P>0.05）、1w（1.216±0.094,0.984±0.094,p<0.05）PKC、RhoA表达较未注射组明显下降。Western blot显示再灌注72h及1w PKCγ及RhoA胞膜蛋白表达明显增加,NogoA反义寡核苷酸明显阻断这种增加。结论PKCγ及RhoA基因表达在缺血再灌注后有两个升高峰,后一个高峰与NogoA的升高相一致,脑室注射Nogo-A反义寡核苷酸能抑制PKCγ及RhoA的表达,表明缺血后Nogo-A的升高参与了PKC/RhoA信号通路的激活。第三部分8-溴环磷酸腺苷及NGF对脑缺血再灌注大鼠cAMP-PKA信号通路及p75NTR蛋白表达的影响目的观察脑室注射神经生长因子（NGF）和8-溴环磷酸腺苷（8-B-cAMP）对脑缺血再灌注大鼠神经再生的影响及其与cAMP-PKA信号途径的关系,并观察NGF对p75NTR蛋白表达的影响。方法采用线栓法制作大鼠脑缺血再灌注模型,大鼠分为假手术对照组,缺血组（单纯脑缺血再灌注组）,NGF1组,NGF2组（脑缺血再灌注并脑室注射NGF,分别注入0.5ug及2.5ug/100g体重）及8-B-cAMP组（脑缺血再灌注并脑室注射8-B-cAMP）。用放免法测缺血周边区脑组织cAMP的含量,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法检测生长相关蛋白43（GAP-43）及蛋白激酶A（PKA）mRNA的表达,免疫组织化学的方法检测p75NTR蛋白表达。结果脑缺血组6h、24h cAMP的含量下降,GAP-43及PKA mRNA表达减少,NGF及8-B-cAMP治疗组脑组织GAP-43 mRNA表达较缺血组增加,且这种变化与cAMP的含量及PKA mRNA表达增加相一致,并呈剂量依赖性。正常大脑皮层神经元无p75NTR表达,缺血再灌注6h有神经元表达,24h表达增加,NGF组p75NTR表达与单纯缺血组无显著性差异。结论NGF和8-B-cAMP能够促进脑缺血再灌注后的轴突再生,cAMP-PKA信号途径在这个过程中起重要作用,脑室注射NGF对p75NTR表达无显著影响。第四部分NGF、8-溴环磷酸腺苷及Nogo-A反义寡核苷酸对脑缺血再灌注大鼠神经再生的影响目的研究侧脑室注射NGF、8-溴环磷酸腺苷（8-B-cAMP）及Nogo-A反义寡核苷酸对脑缺血再灌注大鼠神经再生的影响。方法成年Wistar大鼠分为A组（正常对照组）、B组（单纯缺血组）、C组（NGF组）、D组（8-B-cAMP）及E组（Nogo-A反义寡核苷酸组）。C、D、E组分别经侧脑室注射NGF、8-B-cAMP及Nogo-A反义寡核苷酸。在MCAO后1w,2w和4w进行神经功能评分,Golgi染色观察树突的长度、分支及树突棘的多少,免疫组织化学及Western blot的方法检测GAP-43蛋白表达的变化,4w透射电镜观察大脑皮质突触数量。结果正常对照组神经功能评分为18分,单纯缺血组于再灌注1w,2w及4w神经缺损评分下降（12.20±2.49,13.80±1.30,14.40±1.82,p<0.01）,C、D、E组4w神经缺损评分较单纯血组明显增加,与正常对照组无显著性差异（p>0.05）。单纯缺血组于再灌注1w,2w神经突触数量减少,树突的长度、分支及树突棘的数目下降,GAP-43的表达下降。再灌注4w以上指标有所上升（p<0.05）, C、D、E组突触数量、树突的长度、分支、树突棘的数目及GAP-43蛋白表达较单纯缺血组4w明显增加,其中以神经生长因子的作用最为明显。结论缺血后早期脑室内注射NGF、8-B-cAMP及Nogo-A反义寡核苷酸能够促进脑缺血再灌注大鼠神经突的再生及神经功能的恢复。
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