猪细小病毒非结构蛋白NS1和结构蛋白VP2的研究

论文题目: 猪细小病毒非结构蛋白NS1和结构蛋白VP2的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 动物遗传育种与繁殖

作者: 卿柳庭

导师: 陈焕春,熊远著

关键词: 猪细小病毒,基因,基因,鉴别诊断,干扰,病毒样粒子,表达

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 猪细小病毒病是因感染猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)所致,是导致猪SMEDI综合症(S: stillbirth, M: mummification, ED: embryonic death I: infefitility)的主要疾病之一。PPV主要引起猪繁殖障碍,还可致皮炎和腹泻,与2型圆环病毒(Porcine circovirus type 2, PCV 2)协同感染是导致断奶仔猪多系统衰竭综合症(porcine postweaing mulisystemic wasting syndome, PMWS)的主要原因之一。PPV呈世界性分布,给全球养猪业造成经济损失是巨大的、持续的。接种PPV灭活疫苗是控制PPV感染的有效的措施。灭活苗免疫的猪,多呈全病毒抗体阳性,用现行的血清学诊断方法不能将其与PPV感染猪区分开来,因此,建立一个敏感性高、特异性强、简单快速、易于操作、经济适用,能区分PPV灭活疫苗免疫猪与野毒感染猪的诊断方法有重要的经济和社会意义。 PPV非结构蛋白(NS)对病毒DNA复制、RNA转录及病毒的组装均具有重要作用。PPV持续感染的猪会产生抗NS1蛋白的循环抗体,而接种灭活疫苗或亚单位疫苗免疫的猪却不产生抗NS1蛋白的循环抗体。建立携带PPV非结构蛋白反义RNA的细胞系,细胞系中反义RNA可以抑制PPV复制。 RNA干扰(RNA interference, RNAi)是通过一段双链RNA(dsRNA)导致同源mRNA特异性降解从而使目的基因失去表达的技术。在医学研究中,RNAi可能成为基因治疗的新秀,广泛用于抗病毒、抗肿瘤等疾病治疗。 PPV结构蛋白VP2是主要免疫原性抗原,是抗原决定簇的载体,在昆虫细胞中可高效表达,产物自行装配成病毒样粒子(VLPs)。重组PPV病毒样粒子(PPV∶VLPs)可以用作抗猪细小病毒的有效重组疫苗。PPV∶VLPs可使外源多肽在特定部位表达,既而产生大量具有免疫原性的多肽,从而刺激机体产生高水平抗体和辅助T细胞反应(HTC)及细胞毒性T细胞反应(CTL)反应。 鉴于上述研究背景,本研究探讨了PPV NS1蛋白和VP2蛋白在病毒防治中的应用。主要研究内容如下: 1 用纯化的PPV作抗原,建立了PPV-全病毒-ELISA检测方法,并将其作成商品化试剂盒用于临床。用IBRS-2接种细小病毒,经浓缩和纯化提取全病毒作为抗原包被ELISA板,建立了间接ELISA诊断方法(PPV-全病毒-ELISA),用于检测血清抗体。经试验,最佳抗原包被量为300 ng/孔;最佳血清稀释度是1∶80。与细小病毒乳胶凝集(LAT)诊断方法比较显示:无论检测自然感染猪血清还是免疫猪血清,PPV-全病毒-ELISA的检出阳性率都高,尤其是对于免疫猪血清的检测,PPV-

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目录

摘要

Abstract

第1章 文献综述

1.1 猪细小病毒病研究概述

1.1.1 猪细小病毒病的历史、分布和流行病学

1.1.2 猪细小病毒病的临床症状和病理变化

1.1.3 猪细小病毒病的诊断

1.1.4 猪细小病毒病的免疫预防和控制

1.1.5 猪细小病毒病的病原学

1.2 蛋白质的体外表达

1.2.1 大肠杆菌表达系统

1.2.2 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统简述

1.2.3 杆状病毒表达系统简述

1.3 细小病毒病毒样粒子的研究简述

1.3.1 杆状病毒表达系统在细小病毒VLPs生产中的应用

1.3.2 VLPs作为疫苗载体的研究

1.3.3 PPV-VLPs

1.4 RNA干扰简述

1.4.1 RNAi的发现与发展

1.4.2 机理研究

1.4.3 功能和应用研究

1.4.4 问题与展望

第2章 猪细小病毒灭活疫苗免疫猪与野毒感染猪鉴别诊断方法的建立和应用研究

2.1 研究的目的和意义

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 方法

2.3 结果与分析

2.3.1 PPV细胞毒血凝效价(HA)和感染滴度(TCID_(50))

2.3.2 PPV-全病毒-ELISA的建立与评价结果

2.3.3 临床样品中PPV ns1基因PCR检测方法的建立结果

2.3.4 PPV ns1基因的PCR扩增、克隆及其在大肠杆菌中的表达

2.3.5 PPV-NS1-ELISA的建立与评价结果

2.3.6 PPV ns1基因在巴斯德毕赤酵母菌中的诱导表达研究

2.4 讨论

2.4.1 PPV中国株

2.4.2 PPV-全病毒-EUSA

2.4.3 PCR检测临床样品中PPV ns1基因

2.4.4 PPV ns1基因的PCR扩增、克隆及其在大肠杆菌中的表达

2.4.5 PPV-NS1-EUSA

2.4.6 酶联免疫吸附试验(ELISA)

2.4.7 巴斯德毕赤酵母(P. pasoris)及其外源蛋白表达

2.5 小结

第3章 siRNA抑制PPVns1基因表达及PPV病毒复制的初步研究

3.1 研究的目的和意义

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 方法

3.3 结果与分析

3.3.1 pSilencer-ns244和pSilencer-ns254的构建

3.3.2 pcM4—ns1表达质粒的构建

3.3.3 siRNA抑制PPV-NS1-GFP的融合蛋白表达

3.3.4 siRNA对PPV复制的影响结果

3.4 讨论

3.5 小结

第4章 携带口蹄疫病毒抗原决定簇的猪细小病毒类病毒样粒子的初步研究

4.1 研究的目的和意义

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 方法

4.3 结果与分析

4.3.1 pFast-TVP2的构建结果

4.3.2 重组穿梭载体(Bacmid-Tvp2)的构建

4.3.3 重组杆状病毒AcNPV-TVP_2的收集与保存

4.3.4 AcNPV-TVP_2表达外源蛋白TVP2的分析鉴定

4.4 讨论

4.5 小结

参考文献

致谢

附录1：缩略词表

附录2：CURRICULUM VITAE

附录3：PPV-全病毒-ELISA试剂盒

附录4：PPV-NS1-ELISA试剂盒

发布时间: 2005-12-05

参考文献

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