论文摘要
翻译控制肿瘤蛋白（Translationally controlled tumor protein,TCTP）,又称P21（小鼠TCTP）、P23（人TCTP）、Q23,是一类广泛存在于动物、植物和酵母中在序列上高度保守且有很高同源性的蛋白家族。早期研究认为TCTP是一类生长相关蛋白,近年来,在动物的研究中发现TCTP具有非常重要的生物学功能,能调节细胞周期的进程,抑制细胞恶性转移。此外,该蛋白具有钙结合能力,能促进细胞外组胺释放,具有抗凋亡及抗疟疾等作用。有关TCTP在植物中生物学功能的研究尚未见报道。鉴于此,本论文以唇形科鼠尾草属多年生草本植物丹参（Salviamiltiorrhiza Bunge）为材枓,克隆丹参翻译控制肿瘤蛋白基因SmTCTP,研究该基因在植物体内的表达特征,采用过表达和RNAi等方法对该基因的功能进行初步研究,为进一步阐明植物中TCTP基因的功能奠定基础。主要研究结果如下:1.利用RT-PCR的方法克隆获得丹参翻译控制肿瘤蛋白基因（SmTCTP）,Genbank注册号为:EU182720,该基因开放读码框长为507bp,编码168个氨基酸,序列比对结果显示SmTCTP与其它植物中的TCTP序列具有较高的相似性（大于80%）,且含有TCTP家族的两个特征结构区和微管结合区、钙离子结合区等保守功能域。此外,从DNA水平克隆获得该基因全长1619 bp,通过与cDNA比对发现其由5个外显子和4个内含子组成,内含子插入的位置与拟南芥相似,且内含子两端具有GT/AG保守序列。2.利用TargetP、TMHMM、Protscale、SOPMA和SWISS-MODEL等在线生物信息学软件分析了SmTCTP的导肽、跨膜结构域、亲水/疏水性、蛋白质二级结构与三级结构等。结果表明SmTCTP不存在导肽酶切位点,不具导肽,说明它是一种胞浆蛋白;不存在跨膜结构域;整条蛋白表现出亲水性;α-螺旋、β-折叠片和无规卷曲是SmTCTP的主要结构元件,其三级结构在空间布局上折叠成勺子状,α-螺旋和延伸链构成勺子的底部,而勺子的柄部主要由无规卷曲构成。3.利用real-time quantitative RT-PCR分析该基因在丹参不同器官和不同诱导条件下的表达,结果显示该基因在根、茎、叶中均有不同程度的表达,其表达丰度在叶中最高,茎、根次之。SmTCTP的表达可受NaCl、Cu2+、机械损伤等多种因素的影响,其中400 mmol/L的NaCl溶液可显著影响SmTCTP的表达;500 mg/L的CuSO4溶液处理在短时间内可降低SmTCTP的表达量,处理4 h时SmTCTP的表达量降至最低;创伤处理后SmTCTP表达量先迅速增加然后减小呈现波动趋势,上述结果表明SmTCTP参与了机体对体外刺激的应答过程。4.构建SmTCTP基因过表达及敲除载体pSmTCTP1和pSmTCTP2,利用农杆菌介导的叶盘转化法转化丹参,经60 mg/L卡那霉素筛选以及PCR检测获得了9株阳性过表达植株和21株叶性RNAi植株,转化效率高达到67.7%。进一步分别对转化植株进行SmTCTP的表达分析检测,结果显示RNAi植株中SmTCTP的表达量均明显下降,而过表达植株中只有部分植株显示出基因的过表达。在正常培养条件下,阳性植株与对照植株在表型上无显著差别;在添加40 mmol/LNaCl的1/2MS培养基上,转化植株在第五天开始生根,表现出生根早和生根长的特征;在添加50 mg/L CuSO4的1/2MS培养基上,对照植株第十天开始生根且生长缓慢,转化植株表现出叶片变褐,不生根等异常表型。从而说明SmTCTP参与了丹参对NaCl与CuSO4胁迫的响应过程。
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标签：丹参论文; 翻译控制肿瘤蛋白论文; 基因克隆论文; 过表达论文;