论文题目: 糖多孢红霉菌表达用质粒pSPU237的构建及其应用
论文类型: 硕士论文
论文专业: 微生物与生化药学
作者: 王燕清
导师: 夏焕章
关键词: 糖多孢红霉菌,原生质体制备和再生,介导的原生质体转化,表达用质粒,电转化和接合转移
文献来源: 沈阳药科大学
发表年度: 2005
论文摘要: 糖多孢红霉菌的基因转移系统是实现外源基因表达的前提条件，本文探索了通过PEG-介导的原生质体转化、接合转移、电转化等方法向糖多孢红霉菌中转入外源DNA的可能性。首先从影响接合转移效率的几种主要因素包括预萌发温度及预萌发时间、固体培养基及转化用质粒等考察从大肠杆菌向糖多孢红霉菌转移质粒的可能性，但均未获得转化子。同时我们探索了通过电转化向糖多孢红霉菌转入质粒的可能性。考察了糖多孢红霉菌三种不同的菌体状态，即菌丝体、单孢子、原生质体作为转化受体的效果；同时也考察了不同质粒（pCS5、pIJ702、pKC1139）、不同电压（700v、800v、900v、1000v、1100v、1200v）、不同缓冲液（PGS、EPB）的转化效果，都未得到转化子。PEG-介导的原生质体转化是目前链霉菌中应用最广的基因转移系统，我们试探了用其原生质体转化质粒的可能性。本实验从影响链霉菌原生质体转化的一些主要因素，包括质粒种类、DNase活性、抗生素覆盖时间、修饰—限制系统等因素入手考察红霉素链霉菌原生质体的转化情况，结果都未得到转化子，这可能是因为其原生质体再生率太低造成的，所以本实验考察了其原生质体的形成和再生情况。首先考察了影响糖多孢红霉菌原生质体形成的因素，发现在R2、GMP、SGGP、SM、YEME、CP等几种链霉菌常用的液体培养基中，通过CP培养基收获的菌体形成原生质体的效率最高。菌丝培养采用二级培养，即用CP培养基28℃培养72h，5％转种到补加0.5％甘氨酸的CP培养基中，28℃继续培养24h。溶菌酶作用浓度为2mg／ml，37℃酶解1h。在此条件下，原生质体的制备量为8×108个／ml。通过对洗涤缓冲液中蔗糖浓度及再生培养基中蔗糖浓度、Ca2+、Mg2+浓度、营养成分及不同再生培养基的考察，发现糖多孢红霉菌原生质体在medium2再生培养基中再生率最高，达到5.18％。然后在medium2再生培养基上将质粒pIJ702以PEG-介导方式转入糖多孢红霉菌原生质体中，结果得到了转化子，其转化率为10～100转化子／微克质粒。 为了实现外源基因在糖多孢红霉菌菌体内高效表达以改善红霉素组分及提高发酵液的效价，我们构建了一个糖多孢红霉菌表达用质粒pSPU237。首先利用PCR方法以S.lividsns 1326总DNA为模板扩增得到PmerR启动子，PstⅠ酶切质粒pSPU53获得toterminator，然后将这两个元件连入pIJ2925，构建了质粒pSPU227。BglⅡ酶切质粒pSPU227，回收650bp左右的片段，将其连入pIJ702的BglⅡ位点，成功地构建了糖多孢红霉菌表达用质粒pSPU237。 为了验证质粒pSPU237的表达效果，通过PCR方法扩增得到vhb基因，将该基因连
论文目录:
中文摘要
英文摘要
前言
实验材料
实验方法
1.大肠杆菌质粒DNA小量提取
2.链霉菌质粒DNA的提取
3.链霉菌总DNA的提取
4.重组质粒的快速鉴定
5.大肠杆菌DH-5α感受态细胞的制备
6.质粒DNA转化大肠杆菌
7.DNA酶切和连接
8.DNA电泳和片断回收
9.原生质体的制备、质粒DNA转化
10.电转化
11.接合转移实验
12.超声破碎
13.CO结合差光谱法测定菌体中的VHB
14.PCR反应
结果与讨论
第一部分 糖多孢红霉菌基因转移系统的建立
1.结合转移系统
1.1 糖多孢红霉菌的抗药性考察
1.2 预萌发温度及预萌发时间的考察
1.3 固体培养基的考察
1.4 质粒的考察
2.电激转化系统
3.原生质体转化
3.1 质粒的选择
3.2 PEG介导质粒转化糖多孢红霉菌原生质体的初步尝试
3.3 糖多孢红霉菌原生质体制备和再生的考察及转化系统的建立
4.讨论
第二部分 表达用质粒pSPU227的构建
1.质粒pSPU223的构建
1.1 PCR法扩增PmerR启动子
1.2 PmerR基因的克隆和测序
1.3 质粒pSPU223的构建
2.质粒pSPU226的构建
3.质粒pSPU227的构建
4.质粒pSPU227酶切验证
5.质粒pSPU237的构建
6.讨论
第三部分 质粒pSPU227在糖多孢红霉菌中的应用
1.质粒pSPU238的构建
1.1 透明颤菌血红蛋白基因vhb基因的扩增
1.2 质粒pSPU238的构建
2.vhb基因的表达及其验证
3.讨论
结论
参考文献
致谢
附录
发布时间: 2006-11-27
参考文献
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