基于微流控芯片的肌红蛋白特异性核酸适体的筛选

论文摘要

肌红蛋白是正常存在于人体肌肉中的一种贮氧蛋白，当肌肉损伤时，会高浓度释放到血液中，是肌肉损伤的特异性标志物。很多疾病与肌肉损伤有关，因此肌红蛋白在血液中的水平往往作为一些疾病的指标，比如急性心肌梗死、心绞痛、多发性肌炎等。传统的肌红蛋白检测方法往往在其特异性及检测灵敏度等方面遇到了挑战，因此找到一种能高特异性高亲和力识别肌红蛋白的配体对提高肌红蛋白检测的特异性和灵敏度等方面有着重要的意义。核酸适体作为一种新型的配体，具有目标范围广，稳定性好，生产简单、易于修饰等特点，在很多方面甚至可以与抗体媲美，为解决上述挑战带来了机遇，因此核酸适体的筛选成为近年来研究的焦点。与此同时，微流控芯片作为一种新型的化学、生物分析检测技术平台得到了快速的发展。因其具有快速、高效、高通量、低成本、低样品量、微型化、集成化等优点，特别是在分离领域具有独特的优势，所以越来越多地被用于核酸适体筛选方面的研究。本论文利用不同结构的微流控芯片，以肌红蛋白为筛选目标，对其特异性结合的核酸适体进行了快速筛选，并对得到的序列进行了分析和优化：（1）基于微珠固定的微流控芯片的肌红蛋白特异性核酸适体的筛选通过将肌红蛋白修饰在聚苯乙烯微珠上，并将修饰好的微珠固定于微流控芯片通道内的一个收缩段，借助于微流控芯片在分离中的优点，有效地将与肌红蛋白结合的序列从整个随机文库中分离开来。经过总共6轮的筛选，并对各轮次富集产物进行亲和力的考察，选取第4轮富集产物进行克隆测序，最终获得3条对肌红蛋白亲和力高、特异性好的序列。（2）正反筛单元集成的微流控芯片用于肌红蛋白特异性核酸适体的筛选在第一部分工作的基础上，为了进一步减少整个筛选过程的时间和获得更适合于应用的序列，对芯片的结构和初始文库进行了重新设计。通过设计具有两个收缩段的通道，将目标蛋白和对照蛋白修饰的微珠分别固定，在只通一遍溶液的情况下同时完成正反筛选。在文库序列的设计中，对两端引物序列进行了封闭，有效避免了该部分序列参与到与目标结合时产生的三维结构中。经过8轮的筛选，并对第6、7、8轮富集产物的序列进行测序分析，获得4条亲和力高、特异性好的40个碱基的序列。通过对筛选出序列的二级结构分析，将序列长度进行了优化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 本文所用英文缩略词表
• 第1章 绪论
• 1.1 核酸适体和 SELEX 技术
• 1.1.1 核酸适体的特点
• 1.1.2 SELEX 技术概述及原理
• 1.2 SELEX 技术的发展
• 1.2.1 目标选取及文库设计
• 1.2.2 文库与核酸-目标复合物分离方法
• 1.2.3 单链文库制备方法
• 1.2.4 获取目标序列的方法
• 1.3 基于微珠的微流控芯片在分离中的应用
• 1.3.1 借助磁场-磁珠的分离
• 1.3.2 借助介电泳的分离
• 1.3.3 借助光镊效应的分离
• 1.3.4 借助超声交互作用力的分离
• 1.3.5 障碍物引起的分离
• 1.4 本论文拟开展的工作
• 第2章 基于微珠固定的微流控芯片的肌红蛋白特异性核酸适体的筛选
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂与仪器
• 2.2.2 溶液的配制
• 2.2.3 微流控芯片的设计和制作
• 2.2.4 聚苯乙烯微珠的修饰
• 2.2.5 筛选装置的构建
• 2.2.6 肌红蛋白核酸适体的筛选
• 2.2.7 克隆和测序
• 2.2.8 富集文库及序列亲和力的考察
• 2.2.9 序列特异性考察
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 筛选流程
• 2.3.2 微珠上蛋白修饰密度的测定
• 2.3.3 微珠捕获序列可行性考察
• 2.3.4 PCR 条件的优化
• 2.3.5 筛选富集情况及富集文库亲和力的测定
• 2.3.6 序列比对分析
• 2.3.7 序列特异性考察
• 2.4 小结
• 第3章 正反筛单元集成的微流控芯片用于肌红蛋白特异性核酸适体的筛选
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂与仪器
• 3.2.2 微流控芯片的设计和制作
• 3.2.3 聚苯乙烯微珠的修饰
• 3.2.4 筛选装置的构建
• 3.2.5 肌红蛋白核酸适体的筛选
• 3.2.6 克隆和测序
• 3.2.7 富集文库亲和力的考察
• 3.2.8 序列亲和力测定
• 3.2.9 序列特异性考察
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 筛选流程
• 3.3.2 PCR 条件的优化
• 3.3.3 筛选富集情况及富集文库亲和力测定
• 3.3.4 序列比对分析及亲和力测定
• 3.3.5 序列二级结构分析及序列优化
• 3.3.6 固定序列法考察序列的亲和力
• 3.3.7 序列特异性考察
• 3.3.8 不同序列与肌红蛋白结合位点的初步考察
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文目录
• 致谢