阿霉素/羟丙基-β-环糊精包合物的研究及在磁导靶向给药的应用

论文摘要

恶性肿瘤是严重威胁人类生命的重大疾病。药物治疗在恶性肿瘤的治疗中占有重要地位,将抗肿瘤药物特异性递送到病变组织,不但可以保证药物在病变部位使用剂量,提高药物的治疗效率,而且还大大降低了对正常组织和器官的毒副作用。因此,以高效低毒为目标的肿瘤靶向治疗一直是肿瘤治疗研究的热点。磁导靶向抗肿瘤药物载体,由磁性内核、骨架材料、药物三部分组成,可借助外加磁场实现对恶性肿瘤的靶向给药。针对一线抗肿瘤药物,骨架材料的选择尤为重要。基于生物相容性,生物可降解性等特点,白蛋白、淀粉,壳聚糖等生物高分子材料已经被广泛用作磁导靶向抗肿瘤药物载体的骨架材料。环糊精是一类两端开口直径不同的圆锥状中空筒型环状多糖化合物。环糊精及其衍生物的最大特点是具有特定的空腔,不同尺度的空腔,可以与特定大小和性状的小分子作用形成包合物。目前,环糊精的衍生物羟丙基-β-环糊精已经被中国食品与药品监督管理局（SFDA）批准作为口服药物辅料。美国食品与药品监督管理局（FDA）除批准羟丙基-β-环糊精作为口服药物辅料外,还批准其作为静脉注射药物的辅料。因此,将肾毒性低,溶血和刺激性小的羟丙基-β-环糊精作为磁导靶向抗肿瘤药物载体的骨架材料,研究其与抗肿瘤药物的相互作用特别是形成包合物的性质,对选择适宜的骨架材料,实现磁导靶向给药治疗具有重要意义。本课题首先研究了广谱抗肿瘤药物阿霉素与羟丙基-β-环糊精形成包合物的相关理论问题,并利用MTT和基因芯片技术研究了包合物在体外对肿瘤的抑制作用;合成磁导靶向抗肿瘤药物载体,探讨了对阿霉素的负载以及体外释药的规律。此外,建立了肝癌肿瘤模型,初步开展了载体在体内毒性以及靶向给药后药物在体内不同组织中的分布情况,为进一步体内抗肿瘤治疗研究奠定了基础。以冷冻干燥法制备阿霉素/羟丙基-β-环糊精包合物,通过红外光谱、X射线衍射法、差热扫描法,核磁共振法表征包合物的形成,并利用量化计算及核磁共振数据阐释包合物的结构和阿霉素与羟丙基-β-环糊精之间的包合方式。紫外光谱和荧光光谱证明羟丙基-β-环糊精和阿霉素以1:1的方式络合,荧光光谱滴定计算络合常数Ka为2.08×104M-1。包合物光稳定性实验结果显示单独阿霉素的降解速度(k0=0.0344h-1)与在羟丙基-β-环糊精存在条件下的降解速度(Kc=0.0947 h-1)相差3倍,说明羟丙基-β-环糊精明显延缓了阿霉素的光解,提高了阿霉素的光稳定性。观察阿霉素/羟丙基-β-环糊精包合物对肿瘤细胞Walker-256影响,利用噻唑蓝比色法（MTT法）,通过细胞形态变化,DNA断裂情况分析包合物在体外对肿瘤细胞的抑制作用,利用基因表达谱芯片分析包合物对阿霉素抗肿瘤作用的效果产生机理。MTT实验结果显示包合物增强阿霉素了抑制肿瘤细胞增殖作用,包合物处理肿瘤细胞后基因表达的改变,涉及细胞周期、细胞凋亡、DNA合成、细胞生长增殖、信号传导等过程相关的基因。在基因水平上对阿霉素/羟丙基-β-环糊精包合物抗肿瘤的具体作用机制进行研究,提示羟丙基-β-环糊精可能通过增强阿霉素诱导细胞凋亡作用来提高药效。碱性条件下,超顺磁性纳米粒子和羟丙基-β-环糊精复合,将羟丙基-β-环糊精修饰在磁性纳米粒子表面,制备得到超顺磁性环糊精复合微粒。这种磁性复合微粒粒径在10-20 nm,饱和磁化强度59.9 emu/g,铁离子含量55.35%。磁性复合微粒对阿霉素载药量87.8 ug/mg,包封率67.7%。在体外释药表现出较好的阿霉素缓释功能,1d,4d,10d的累积释药量分别为35.5%,49.3%和76.5%。大鼠体内初步实验,观察磁性复合微粒的靶向性和组织病理表现,证实介入注射磁性复合微粒引起组织可逆性轻度炎症反应,磁粒具有明显的肝靶向性。载药复合磁粒在肝癌大鼠内组织阿霉素浓度检测显示在外加磁场作用下,阿霉素可以有效聚集在肝脏靶部位,显示出肝组织阿霉素浓度明显高于肺、心、肾。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 第二章 阿霉素/羟丙基-β-环糊精包合作用的研究
• 第一节 前言
• 1 阿霉素的结构与功能
• 2 环糊精的结构和药学应用
• 3 羟丙基-β-环糊精在药学上的应用
• 4 环糊精与阿霉素的相互作用
• 5 影响环糊精包合的因素
• 6 环糊精包合物的制备方法
• 7 环糊精包合物表征方法
• 7.1 核磁共振法
• 7.2 差热分析法
• 7.3 红外光谱法
• 7.4 X射线衍射法
• 7.5 紫外光谱法
• 7.6 荧光光谱法
• 7.7 圆二色谱法
• 7.8 量子化学模拟
• 第二节 阿霉素/羟丙基-β-环糊精包合作用的研究
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 羟丙基-β-环糊精的溶解度测定和结构确证
• 2.2 包合物的制备
• 2.3 红外光谱检测
• 2.4 X-射线衍射（X-RD）
• 2.5 差示扫描量热法（DSC）
• 2.6 核磁共振碳谱检测
• 2.7 计算机辅助判断包合可能性
• 2.8 包合物紫外光谱研究
• 2.9 包合物荧光光谱研究
• 2.10 包合物光稳定性实验
• 3 结果和讨论
• 3.1 羟丙基-β-环糊精性状
• 3.2 分子量的测定
• 3.3 包合物制备
• 3.4 红外光谱检测结果
• 3.5 X-RD检测结果
• 3.6 DSC检测结果
• 3.7 核磁共振检测结果
• 3.8 计算机量化计算结果
• 3.8.1 羟丙基-β-环糊精的构型优化
• 3.8.2 阿霉素的构型优化
• 3.8.3 包合物构型的优化
• 3.9 紫外吸收光谱结果
• 3.10 包合物荧光光谱研究结果
• 3.11 光稳定性实验结果
• 4 结论
• 参考文献
• 第三章 阿霉素/羟丙基-β-环糊精包合物体外抗肿瘤作用研究
• 第一节 前言
• 第二节 实验部分
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 细胞株
• 2 方法
• 2.1 样品制备
• 2.2 细胞培养及细胞悬液制备
• 2.3 阿霉素/羟丙基-β-环糊精包合物体外抑瘤效应
• 2.3.1 MTT法检测细胞毒作用
• 2.3.2 细胞形态学观察
• 2.3.3 DNA产量及纯度检测
• 2.3.4 细胞总RNA的提取
• 2.3.5 cRNA的制备
• 2.3.6 cRNA荧光标记
• 2.3.7 杂交反应
• 2.3.8 芯片清洗
• 2.3.9 数据采集与分析
• 3 实验结果与讨论
• 3.1 MTT法测定结果
• 3.2 相差显微镜观察细胞形态
• 3.3 透射电镜结果
• 3.4 不同处理后提取的DNA
• 3.5 不同处理后提取的RNA
• 3.6 芯片杂交结果
• 3.7 数据分析结果
• 4 结论
• 参考文献
• 第四章 磁性羟丙基-β-环糊精复合微粒的制备及体外载释药研究
• 第一节 前言
• 1 磁性复合微粒
• 2 磁性复合微粒的制备方法
• 3 磁性复合微粒作为药物载体的应用
• 3.1 在磁靶向药物载体中运用
• 3.2 环糊精在磁性靶向药物载体上的应用
• 第二节 实验部分
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 磁性羟丙基-β-环糊精复合微粒的制备
• 3O₄磁性纳米颗粒的制备'>2.1.1 Fe₃O₄磁性纳米颗粒的制备
• 2.1.2 磁性羟丙基-β-环糊精复合微粒的制备
• 2.2 磁性羟丙基-β-环糊精复合微粒的表征方法
• 2.2.1 红外光谱分析
• 2.2.2 观测磁性微粒的磁学性质
• 2.2.3 电感耦合等离子发射仪测定磁性微粒中的铁离子含量
• 2.2.4 透射电子显微镜（TEM）观察微粒形态结构
• 2.3 磁性羟丙基-β-环糊精复合微粒体外释药实验
• 2.3.1 阿霉素浓度的确定
• 2.3.2 磁性羟丙基-β-环糊精复合微粒载药的制备
• 2.3.3 阿霉素/羟丙基-β-环糊精磁性复合微粒载药率、包封率的计算
• 2.3.4 阿霉素/羟丙基-β-环糊精磁性复合微粒的体外释药实验
• 3 结果
• 3.1 红外结果
• 3.2 磁性羟丙基-β-环糊精复合微粒的磁学性质
• 3.3 磁性羟丙基-β-环糊精复合微粒的粒径表征
• 3.4 体外载药与释药实验
• 3.4.1 载药条件的优化
• 3.4.2 载药温度的优化
• 3.4.3 载药时间的优化
• 3.4.4 载药量与包封率的关系
• 3.4.5 载药微粒的体外释放形式
• 4 结论
• 参考文献
• 第五章 载阿霉素磁性羟丙基-β-环糊精复合微粒的体内初步研究
• 第一节 前言
• 1 肿瘤靶向治疗策略
• 2 磁性纳米载体作为抗癌药物载体的特点
• 3 磁靶向药物载体的临床应用
• 第二节 实验部分
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 磁性羟丙基-β-环糊精复合微粒和载阿霉素磁性羟丙基-β-环糊精复合微粒制备
• 2.2 大鼠移植性肝癌模型的制作
• 2.3 手术方法
• 2.4 实验动物分组
• 2.5 效应指标和资料收集方法
• 2.6 组织和血中阿霉素含量测定方法的建立
• 3 结果和讨论
• 3.1 模型制备
• 3.2 磁性复合微粒注射后病理观察
• 3.3 移植性肝癌大鼠组织药物浓度
• 4 结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表论文
• 致谢