论文摘要
杂色曲霉素（sterigmatocystin, ST）是杂色曲霉、构巢曲霉等曲霉菌属真菌所产生的一种低分子量毒性代谢产物,广泛存在于自然界,是人类和动物食物中最常见的污染物之一。国内外研究发现,ST具有致癌性、致突变性和免疫毒性等生物学效应。同时,ST可以对很多实验动物的脏器造成急性毒性损伤,并且具有种属及器官特异性。在短期实验中,ST的遗传毒性表现为可以直接造成细胞DNA损伤,与DNA形成加合物,还能引起染色体畸变,姐妹染色单体互换等。在长期实验中,ST可诱导实验动物发生肝癌、肺癌、间皮瘤等肿瘤。ST已被国际癌症研究中心列为“可能的人类致癌物”。本室前期研究发现,ST可诱发体外培养人胚胃黏膜细胞增殖活跃及抑癌基因p53的突变、过表达;长期灌胃ST可以引起小鼠腺胃黏膜的肠上皮化生和腺上皮不典型增生。ST是我国河北省南部胃癌、食管癌高发区粮食中最常见的霉菌毒素污染物之一。大量的肿瘤病因流行病学研究表明,ST的饮食暴露可能与该区域胃癌高发有关。因此,深入研究ST对人胃粘膜上皮细胞的细胞毒性作用,可为进一步探讨ST的可能致癌机制提供必要的实验依据,且具有重要的现实意义。细胞增殖与死亡之间的失衡常被认为是肿瘤发生过程中的重要环节。当外界刺激因素引起细胞DNA损伤时,将通过启动检测点机制而诱导细胞发生周期阻滞,这使得细胞有充足的时间修复受损DNA,但修复失败的细胞则被诱导发生凋亡。这一过程对于维持基因组的稳定性具有重要意。检测点调控紊乱引起的细胞周期和凋亡异常可能导致细胞基因组失稳、基因突变和DNA异倍体出现,甚至发生癌变。研究表明,很多致癌性毒素的早期效应多是诱发细胞周期紊乱、增殖抑制及凋亡异常等。谢同欣等发现,ST可诱导小鼠胚胎纤维母细胞细G2/M期阻滞及p53蛋白表达上调。本室也证实,ST作用于人胃粘膜上皮细胞24小时可通过影响MAPK通路而诱导其发生G2期阻滞。DNA损伤检测点信号转导途径是一个高度保守的信号感应过程。ATM/ATR是能早期感应DNA损伤信号的蛋白激酶,其活性的增加构成了整个途径活化的第一步,p53是ATM的底物之一,它能够根据损伤的严重程度,或激活细胞周期检测点,诱导周期阻滞从而修复DNA,或启动细胞进入凋亡途径。为进一步阐明ST的细胞毒性作用及可能机制,本研究以永生化人正常胃黏膜上皮细胞（GES-1）为研究对象,初步探讨了ST的致损伤作用及其相关机制。我们首先观察了ST较长期作用对GES-1细胞周期进程以及细胞增殖与凋亡的影响;接下来检测了ST对GES-1细胞DNA的损伤作用及其下游可能的损伤信号传导途径;最后以同时与DNA损伤和细胞周期阻滞、凋亡密切相关的p53-p21WAF1/CIP1信号通路为研究靶点,深入探讨了ST诱导GES-1细胞G2期阻滞及凋亡的分子机制。为揭示ST饮食暴露与人胃黏膜损伤乃至胃癌发生的可能关系奠定实验基础,对提高我国胃癌高发区居民食品安全水平具有重要意义。本研究论文共分为三个部分:第一部分杂色曲霉素对GES-1细胞增殖和凋亡的影响目的:探讨杂色曲霉素对体外培养的人胃黏膜上皮细胞（GES-1）细胞周期分布以及细胞增殖与凋亡的影响。方法:采用噻唑蓝（MTT）比色法观察不同浓度（0.0348μM） ST作用24、48及72 h对GES-1细胞存活率的影响。流式细胞定量检测（FCM）不同时间（212 d）及不同浓度（0.0753μM） ST处理后GES-1细胞周期分布情况。蛋白质免疫印迹（Western Blot）、反转录聚合酶联反应（RT-PCR）方法检测ST处理后G2/M期关键调节分子—Cdc25C、Cdc2和CyclinB1在蛋白水平和mRNA水平上的表达情况。免疫共沉淀技术检测Cdc2-CyclinB1复合物的形成情况。PI单染法和annexin V-PI双染法检测ST对GES-1细胞凋亡的影响。Hoechst 33258染色从形态上检测ST对GES-1细胞凋亡的的影响。Western Blot检测凋亡相关蛋白Bxl-2、Bax和NF-κB的表达变化及Caspase-3的激活情况。结果:1.1 ST对GES-1细胞存活率的影响MTT法检测结果显示,ST处理24 h,348μM浓度范围的ST处理组GES-1细胞存活率均较溶剂对照组明显降低（P<0.05）,且呈剂量依赖性（r24h=-0.961, P<0.01）;ST处理48及72h,在1.548μM浓度范围内,各ST处理组细胞存活率分别明显低于各自相应的溶剂对照组（P<0.05）,且呈剂量依赖性（r48h=-0.955, r72h=-0.913, P<0.01）。在24μM和48μM两个ST处理浓度,随着ST作用时间的延长GES-1细胞的存活率均明显降低,呈时间依赖性（r24μM=-0.998,r48μM =-0.998, P<0.05）。提示ST对GES-1细胞的生长有明显的抑制作用,且呈时间、剂量依赖地方式。1.2 ST对GES-1细胞周期分布的影响1.2.1 ST作用不同时间对GES-1细胞周期及其关键调节因子的影响1.2.1.1 ST作用不同时间对GES-1细胞周期分布的影响FCM检测结果表明,3μM ST 2d、4d、8d及12d处理组细胞G2/M期细胞比例明显增加（P<0.05）,且随着ST作用时间的延长,G2/M期细胞比例先增高后降低,峰值出现在ST作用后第4天（P<0.05）。1.2.1.2 ST作用不同时间对GES-1细胞G2期关键调节因子的影响Western Blot结果显示,3μM ST处理2d、4d、8d及12d可以降低GES-1细胞内Cdc25C的去磷酸化水平（P<0.05）和升高其磷酸化水平（P<0.05）,并且分别呈时间依赖性（r=-0.814,r=0.807,P<0.01）。各ST不同时间处理组GES-1细胞Cdc25C在mRNA水平上的表达明显低于对照组（P<0.05）。Western Blot结果显示,3μM ST 2d、4d处理组细胞Cdc2蛋白水平较对照组明显降低（P<0.05）,但ST 8d及12d处理组又逐渐恢复至对照组水平。各不同时间处理组Cdc2的磷酸化水平较对照组有明显升高（P<0.05）,且呈时间依赖性（r= 0.603,P<0.01）。各处理组GES-1细胞Cdc2的mRNA表达量均明显低于溶剂对照组（P<0.05）。Western Blot结果显示,3μM ST 2d、4d、8d及12d处理组CyclinB1蛋白表达水平均较对照组明显升高（P<0.05）。各处理组GES-1细胞CyclinB1的mRNA表达量均明显高于溶剂对照组（P<0.05）。1.2.2不同浓度ST对GES-1细胞周期及其关键调节因子的影响1.2.2.1不同浓度ST作用4天对GES-1细胞周期及其关键调节因子的影响1.2.2.1.1不同浓度ST作用4天对GES-1细胞周期分布的影响FCM检测结果表明,ST处理4天后,0.3μM、1.5μM、3μM ST处理组G2/M期细胞比例均较溶剂对照组明显增加（P<0.05）,并且在0～3μM浓度范围内,G2/M期细胞比例与ST的处理浓度呈正相关关系（r=0.927,P<0.01）。1.2.2.1.2不同浓度ST作用4天对GES-1细胞G2期关键调节因子的影响Western Blot结果显示,ST作用4天后, 0.3μM、1.5μM和3μM ST处理组细胞的Cdc25C和Cdc2蛋白表达水平较溶剂对照组明显减少（P<0.05）,且分别呈剂量依赖性（r=-0.800, r=-0.876, P<0.01）;而Cdc25C和Cdc2的磷酸化水平则较溶剂对照组明显增加（P<0.05）,且呈剂量依赖性（r=0.714, r=0.767, P<0.01）。各处理组Cdc25C和Cdc2的mRNA表达量均明显低于溶剂对照组（P<0.05）。Western Blot结果显示,ST作用4天后,0.3μM、1.5μM和3μM ST处理组细胞的Cyclin B1蛋白表达水平较溶剂对照组明显增加（P<0.05）,且呈剂量依赖性（r=0.929, P<0.01）。1.2.2.1.3不同浓度ST作用4天对GES-1细胞Cdc2-CyclinB1复合物的影响免疫共沉淀结果显示,ST作用4天后,Cdc2和CyclinB1可以以复合物的形式存在,0.075μM、0.3μM、1.5μM和3μM ST处理4天可以减少Cdc2-CyclinB1复合物的形成。1.2.2.2不同浓度ST作用8天对GES-1细胞周期及其关键调节因子的影响1.2.2.2.1不同浓度ST作用8天对GES-1细胞周期分布的影响FCM检测结果表明,ST处理8天后,0.3μM、1.5μM、3μM ST处理组G2/M期细胞比例均较溶剂对照组明显增加（P<0.05）,并且在0～3μM浓度范围内,G2/M期细胞比例与ST的处理浓度呈正相关关系（r=0.910,P<0.01）。1.2.2.2.2不同浓度ST作用8天对GES-1细胞G2期关键调节因子的影响Western Blot结果显示,不同浓度ST作用于GES-1细胞8天后,1.5μM和3μM ST处理组细胞的Cdc25C蛋白表达水平较溶剂对照组明显减少（P<0.05）,且在ST 0.33μM的浓度范围内呈剂量依赖性（r=-0.830,P<0.01）;而Cdc25C的磷酸化水平则较溶剂对照组明显增加（P<0.01）,且在ST 0.33μM的浓度范围内呈剂量依赖性（r=0.752, P<0.01）。各处理组Cdc25C的mRNA表达量均明显低于溶剂对照组（P<0.05）。Western Blot结果显示,不同浓度ST处理细胞8天后,各浓度处理组中只有3μM ST处理组细胞的Cdc2蛋白表达水平较溶剂对照组下降（P<0.05）;但各浓度处理组Cdc2的磷酸化水平均较溶剂对照组明显增加（P<0.05）,且呈剂量依赖性（r=0.781,P<0.01）。各处理组Cdc2的mRNA表达量均明显低于溶剂对照组（P<0.05）。Western Blot结果显示,不同浓度ST处理细胞8天后,0.3μM、1.5μM和3μM ST处理组细胞的Cyclin B1蛋白表达水平较溶剂对照组明显增加（P<0.05）,且在ST 0.33μM的浓度范围内呈剂量依赖性（r=0.753, P<0.01）。各浓度处理组GES-1细胞CyclinB1的mRNA表达量均明显高于溶剂对照组（P<0.05）。1.3 ST对GES-1细胞凋亡的影响1.3.1 ST作用不同时间对GES-1细胞凋亡的影响1.3.1.1 ST作用不同时间对GES-1细胞凋亡率的影响PI单染法检测细胞凋亡率,结果表明, GES-1细胞经3μM ST处理2d、4d、8d及12d后,各ST处理组细胞凋亡率分别为3.11±0.69%,4.07±0.71%,7.96±1.17%及3.89±0.28%,其中ST 4d、8d及12d处理组细胞的凋亡率均高于溶剂对照组2.19±0.08% （P<0.05）,并且细胞凋亡的高峰出现在ST处理后第8天,12天又有明显下降（P<0.01）。表明3μM ST可以诱导GES-1细胞发生凋亡,且凋亡的高峰期出现在ST处理后8天,此时间晚于ST诱导的G2期阻滞的高峰期4天。提示ST作用于GES-1细胞时凋亡的发生晚于其诱导的G2期阻滞。1.3.1.2 Hoechst 33258染色检测ST作用不同时间GES-1细胞凋亡情况3μM ST ST处理GES-1细胞经Hoechst33258染色后,荧光显微镜下观察可见细胞核染色质凝集、固缩,或核碎裂呈碎块状,颜色呈致密浓染的亮蓝色。ST作用2至8天随着ST作用时间的延长,凋亡指数（AI,%）逐渐升高（r=0.827, P<0.01, Fig. 12B）,至8天达最大值,12天又有所下降（P<0.05）。1.3.1.3 ST作用不同时间对GES-1细胞凋亡相关蛋白表达的影响1.3.1.3.1 ST作用不同时间对GES-1细胞Bcl-2表达的影响Western Blot结果显示,3μM ST作用2d、4d、8d及12d后,细胞的Bcl-2蛋白表达水平分别较溶剂对照组明显降低（P<0.05）,且其表达量随着ST作用时间的延长而减少（r=-0.557, P<0.05）。提示ST处理可以时间依赖性地下调GES-1细胞内Bcl-2蛋白的表达。1.3.1.3.2 ST作用不同时间对GES-1细胞Bax表达的影响Western Blot结果显示,3μM ST作用2d、4d、8d及12d后,细胞的Bax蛋白表达水平分别较溶剂对照组明显升高（P<0.05）,且其表达量在8 d达高峰后,12天又有明显下降（P<0.05）。提示ST处理GES-1细胞可以上调Bax蛋白的表达,且表达量的峰值出现在ST处理后8天,与细胞凋亡的高峰时间一致。1.3.1.3.3 ST作用不同时间对GES-1细胞NF-κB表达的影响Western Blot结果显示,3μM ST作用2d、4d、8d及12d后,细胞的NF-κB蛋白表达水平分别较溶剂对照组明显下降（P<0.05）,且其表达量随着ST作用时间的延长而减少（r=-0.825,P<0.01）。提示ST处理可以时间依赖性地下调GES-1细胞内NF-κB蛋白的表达。1.3.1.3.4 ST作用不同时间对Caspase-3蛋白表达的影响Western Blot结果显示,3μM ST 2d、4d、8d及12d处理组均出现了Caspase-3的活性片段,且随ST处理作用时间的延长,阳性条带颜色逐渐加深（P<0.05）,并在ST处理8 d时表达量达到峰值,之后12 d又有明显的下降（P<0.05）。表明ST处理可以激活GES-1细胞Caspase-3,且其活性片段表达水平的变化与ST处理后细胞凋亡率的变化趋势一致。1.3.2不同浓度ST对GES-1细胞凋亡的影响1.3.2.1不同浓度ST作用4天对GES-1细胞凋亡的影响1.3.2.1.1不同浓度ST作用4天对GES-1细胞凋亡率的影响PI单染法检测细胞凋亡率,结果表明, GES-1细胞经不同浓度ST处理4 d后,0.075μM、0.3μM、1.5μM和3Μm ST处理组细胞凋亡率明显高于溶剂对照组（P<0.05）,且随浓度的增加凋亡率逐渐升高（r=0.854, P<0.01）。进一步应用Annexin V/PI双染法检测凋亡率,结果表明,不同浓度ST处理4天后GES-1细胞早期和晚期凋亡率都较溶剂对照组显著升高（P<0.05）,并且早期和晚期凋亡率之和也相应增加（P<0.05）,与PI单染法结果一致。综合以上两种方法表明,ST作用4天可以剂量依赖性地诱导体GES-1细胞发生凋亡。1.3.2.1.2不同浓度ST作用4天对GES-1细胞凋亡相关蛋白表达的影响1.3.2.1.2.1不同浓度ST作用4天对GES-1细胞Bcl-2表达的影响Western Blot结果显示,ST作用4天后,0.075μM、0.3μM、1.5μM和3μM ST处理组细胞的Bcl-2蛋白表达水平较溶剂对照组明显降低（P<0.05）,且其表达量随着ST浓度的增加而减少（r=-0.857, P<0.05）。提示ST处理4天可以剂量依赖性地下调GES-1细胞内Bcl-2蛋白的表达。1.3.2.1.2.2不同浓度ST作用4天对GES-1细胞Bax表达的影响Western Blot结果显示,ST作用4天后,0.0753μM ST处理组细胞的Bax蛋白表达水平较溶剂对照组明显升高（P<0.05）,且其表达量随着ST浓度的增加而升高（r=0.907,P<0.01）。提示ST处理4天可以剂量依赖性地上调GES-1细胞内Bax蛋白的表达。1.3.2.1.2.3不同浓度ST作用4天对GES-1细胞NF-κB表达的影响Western Blot结果显示,ST作用4天后,0.3μM、1.5μM和3μM ST处理组细胞的NF-κB蛋白表达水平较溶剂对照组明显下降（P<0.05）,且其表达量随着ST浓度的增加而减少（r=-0.828, P<0.01）。提示ST处理4天可以剂量依赖性地下调GES-1细胞内NF-κB蛋白的表达。1.3.2.1.2.4不同浓度ST作用4天对Caspase-3蛋白表达的影响Western Blot结果显示,ST作用4天后,各浓度ST处理组Caspase-3活性片段都较溶剂对照组明显增加（P<0.01）,且随ST浓度增加阳性酶切片段的表达量逐渐升高（r=0.905,P<0.05）。表明ST处理4天可以激活GES-1细胞Caspase-3,且其活性片段表达水平以剂量依赖方式增加。1.3.2.2不同浓度ST作用8天对GES-1细胞凋亡的影响1.3.2.2.1不同浓度ST作用8天对GES-1细胞凋亡率的影响PI单染法检测细胞凋亡率,结果表明, GES-1细胞经不同浓度ST处理8 d后,0.3μM、1.5μM和3μM ST处理组细胞凋亡率均明显高于溶剂对照组（P<0.05）,且随浓度的增加凋亡率逐渐升高（r=0.933, P<0.01）。提示ST作用8天可以剂量依赖性地诱导体外培养人胃黏膜上皮细胞GES-1发生细胞凋亡。1.3.2.2.2不同浓度ST作用8天对GES-1细胞凋亡相关蛋白表达的影响1.3.2.2.2.1不同浓度ST作用8天对GES-1细胞Bcl-2表达的影响Western Blot结果显示,ST作用8天后,0.3μM、1.5μM和3μM ST处理组细胞的Bcl-2蛋白表达水平较溶剂对照组明显降低（P<0.05）,且其表达量随着ST浓度的增加而减少（r=-0.912, P<0.05）。提示ST处理8天可以剂量依赖性地下调GES-1细胞内Bcl-2蛋白的表达。1.3.2.2.2.2不同浓度ST作用8天对GES-1细胞Bax表达的影响Western Blot结果显示,ST作用8天后,0.3μM、1.5μM和3μM ST处理组细胞的Bax蛋白表达水平较溶剂对照组明显升高（P<0.05）,且其表达量随着ST浓度的增加而升高（r=0.901, P<0.01）。提示ST处理8天可以剂量依赖性地上调GES-1细胞内Bax蛋白的表达。1.3.2.2.2.3不同浓度ST作用8天对GES-1细胞NF-κB表达的影响Western Blot结果显示,ST作用8天后,0.3μM、1.5μM和3μM ST处理组细胞的NF-κB蛋白表达水平较溶剂对照组明显下降（P<0.05）,且其表达量随着ST浓度的增加而减少（r=-0.803,P<0.01）。提示ST处理8天可以剂量依赖性地下调GES-1细胞内NF-κB蛋白的表达。1.3.2.2.2.4不同浓度ST作用8天对Caspase-3蛋白表达的影响Western Blot结果显示,ST处理8天后,0.0753μM各ST处理组Caspase-3活性片段的表达均较溶剂对照组明显增加（P<0.01）,且随着ST浓度的增加,阳性酶切片段的表达量逐渐升高（r=0.850,P<0.01）。表明ST处理8天可以激活GES-1细胞Caspase-3,且其活性片段表达水平以剂量依赖方式增加。第二部分杂色曲霉素对GES-1细胞DNA的损伤作用及损伤通路的激活目的:探讨杂色曲霉素对人胃黏膜上皮细胞（GES-1） DNA的损伤作用及其下游损伤通路的激活情况,揭示ST诱导GES-1细胞G2期阻滞的可能原因。方法:采用单细胞凝胶电泳试验观察ST作用不同时间（2、4、8及12d）对GES-1细胞DNA的损伤情况;采用FCM和Western Blot方法检测ATM/ATR特异性阻断剂—caffeine预处理对ST诱导的G2期阻滞及相关调控因子的影响。结果:2.1 ST对GES-1细胞DNA损伤的影响单细胞凝胶电泳试验结果显示,3μM ST作用于GES-1细胞可引起DNA的损伤。各不同时间ST处理组与相应溶剂对照组相比,DAN损伤指数（DI）显著增高（P<0.001）,且随着ST作用时间的延长DI逐渐升高,两者呈正相关关系（r=0.903, p<0.001）。不同时间ST处理的GES-1细胞在电泳之后经软件分析出的彗星尾部DNA含量、尾长及尾距三个指标与相应的溶剂对照组相比均有显著地增加,并且存在明显的时效关系（P<0.01）。以上结果提示,ST可以引起GES-1细胞DNA损伤,且随ST作用时间的延长DNA损伤程度相应加重,它可能参与了ST诱导的细胞G2期阻滞。2.2 Caffeine预处理对ST诱导的GES-1细胞G2期阻滞及细胞周期相关蛋白的影响2.2.1 Caffeine预处理对ST诱导的GES-1细胞G2期阻滞的影响FCM检测结果显示,caffeine预处理+ST 3μM处理组与ST单独处理组相比,G2/M期细胞比例明显减少（P<0.05）。表明caffeine预处理可以阻断ST诱导的细胞G2/M期比例增高,提示ATM/ATR信号通路的激活可能参与了ST诱导的GES-1细胞G2期阻滞。2.2.2 Caffeine预处理对ST作用后GES-1细胞G2期关键调节因子表达变化的影响2.2.2.1 Caffeine预处理对Cdc25C表达的影响Western Blot结果显示,5 mM caffeine预处理+ST（1.5μM, 3μM）处理组Cdc25C的表达水平与ST（1.5μM, 3μM）单独处理组相比明显提高（P<0.05）;而Cdc25C的磷酸化水平在caffeine预处理后较ST单独处理组有所降低（P<0.05）。提示ATM/ATR信号通路可能参与了ST诱导的Cdc25C表达降低和p-Cdc25C表达的升高。2.2.2.2 Caffeine预处理对Cdc2表达的影响Western Blot结果显示,5 mM caffeine预处理+ST（1.5μM , 3μM）处理组Cdc2的表达水平与ST（1.5μM, 3μM）单独处理组相比明显升高（P<0.05）;而Cdc2的磷酸化水平在caffeine预处理后则有所降低（P<0.05）。提示ATM/ATR信号通路可能参与了ST诱导的Cdc2表达的降低和p-Cdc2表达的升高。2.2.2.3 Caffeine预处理对CyclinB1表达的影响Western Blot结果显示,5 mM caffeine预处理+ST（1.5μM , 3μM）处理组CyclinB1的表达水平与ST单独处理组相比无明显变化（P>0.05）。2.3 Caffeine预处理对p-p53表达的影响Western Blot结果显示,与溶剂对照组相比,5mM caffeine预处理组p-p53的表达水平显著降低;1.5μM ST和3μM ST单独处理组p-p53的表达水平均明显升高（P>0.05）;5 mM caffeine预处理+ST（1.5μM , 3μM）处理组p-p53的表达水平与ST（1.5μM , 3μM）单独处理组相比明显降低（P>0.05）。提示,ST作用2天激活了p53;p53是ATM/ATR信号通路中的的一员;ATM/ATR信号通路可能参与了ST诱导的p-p53表达的升高。第三部分杂色曲霉素诱导GES-1细胞周期G2期阻滞及凋亡的可能分子机制目的:探讨杂色曲霉素诱导体外培养的人胃黏膜上皮细胞（GES-1）G2期阻滞及凋亡的可能分子机制。方法:采用Western Blot和real-time PCR技术观察ST对p53-p21WAF1/CIP1信号通路相关分子表达的影响。进一步通过p53 siRNA转染干扰p53基因表达,Western Blot方法检测p53-p21WAF1/CIP1信号通路相关分子及细胞G2/M期调控因子的表达变化情况,FCM方法检测细胞周期的变化情况。结果:3.1 ST对GES-1细胞p53-p21WAF1/CIP1信号通路的影响3.1.1 ST作用不同时间对p53-p21WAF1/CIP1信号通路的的影响3.1.1.1 ST作用不同时间对p53蛋白的影响Western Blot结果显示,3μM ST处理GES-1细胞2、4、8及12天后,各ST处理组p-p53（Ser15）和p53蛋白水平均较对照组明显升高（P<0.05）;在ST处理8天时p-p53（Ser15）的表达量达最大值,12天又明显下降（P<0.05）。提示ST处理GES-1细胞可以时间依赖性地激活p53,并且p-p53在第8天出现峰值后12天又下降。Real time-PCR检测结果显示, ST 2、4、8及12d处理组的p53 mRNA水平均较对照组明显升高（P<0.01）,且ST作用8天时达峰值,12天时又下降（P<0.05）。提示,ST作用于GES-1细胞可以上调p53 mRNA的表达,且第8天出现峰值,之后下降。与p53在蛋白水平上的激活时间保持一致。以上p53的激活在时间上与G2期阻滞和凋亡基本一致。3.1.1.2 ST作用不同时间对p21WAF1/CIP1蛋白的影响Western Blot结果显示,3μM ST处理GES-1细胞2、4、8及12天后,各ST处理组p21WAF1/CIP1蛋白水平均较对照组明显升高（P<0.05）;在ST处理后8天时其表达量达最大值,12天又有所下降（P<0.05）。提示ST作用于GES-1细胞可以时间依赖性地激活p21WAF1/CIP1,并且其在第8天出现峰值后12天又下降。p21WAF1/CIP1的激活在时间上在时间上与G2期阻滞和凋亡基本一致。3.1.2不同浓度ST对p53-p21WAF1/CIP1信号通路的的影响3.1.2.1不同浓度ST作用4天对p53-p21WAF1/CIP1信号通路的的影响3.1.2.1.1不同浓度ST作用4天对p53蛋白的影响Western Blot结果显示,0.075μM、0.3μM、1.5μM及3μM ST处理GES-1细胞4 d后,各ST处理组p-p53（Ser15）蛋白水平均较溶剂对照组明显升高（P<0.05）;除0.075μM ST处理组外,各ST处理组p53蛋白水平较溶剂对照组明显升高（P<0.05）。并且p53的去磷酸化和磷酸化水平均随ST浓度的增加而升高（r=0.893; r=0.866, P<0.01）。提示ST作用于GES-1细胞4天可以剂量依赖性地激活p53。Real time-PCR检测结果显示,除0.075μM ST处理组外,其它各ST处理组的p53 mRNA水平均较溶剂对照组明显升高（P<0.01）。提示,不同浓度ST作用于GES-1细胞4天可以上调p53 mRNA的表达。3.1.2.1.2不同浓度ST作用4天对p21WAF1/CIP1蛋白的影响Western Blot结果显示,0.075μM、0.3μM、1.5μM及3μM ST处理GES-1细胞4 d后,各ST处理组p21蛋白表达水平均较溶剂对照组明显升高（P<0.05）,且随ST浓度的增加而升高（r=0.910, P<0.01）。提示ST作用于GES-1细胞4天可以剂量依赖性地激活p21WAF1/CIP1。3.1.2.2不同浓度ST作用8天对p53-p21WAF1/CIP1信号通路的影响3.1.2.2.1不同浓度ST作用8天对p53蛋白的影响Western Blot结果显示,0.075μM、0.3μM、1.5μM及3μM ST处理GES-1细胞8 d后,各ST处理组p-p53（Ser15）蛋白水平均较溶剂对照组明显升高（P<0.05）;除0.075μM ST处理组外,各ST处理组p53蛋白水平较溶剂对照组明显升高（P<0.05）。并且p53的去磷酸化和磷酸化水平均随ST浓度的增加而升高（r=0.836; r=0.879, P<0.01）。提示ST作用于GES-1细胞8天可以剂量依赖性地激活p53。3.1.2.2.2不同浓度ST作用8天对p21WAF1/CIP1蛋白的影响Western Blot结果显示,0.075μM、0.3μM、1.5μM及3μM ST处理GES-1细胞8 d后,各ST处理组p21蛋白表达水平均较溶剂对照组明显升高（P<0.05）,且随ST浓度的增加而升高（r=0.926, P<0.01）。提示ST作用于GES-1细胞8天可以剂量依赖性地激活p21WAF1/CIP1。3.2 p53 siRNA转染对ST作用后GES-1细胞的影响3.2.1 p53 siRNA转染对ST作用后GES-1细胞p53-p21WAF1/CIP1信号通路的影响3.2.1.1 p53 siRNA转染对ST作用后GES-1细胞p53蛋白的影响Real time PCR结果显示,p53 siRNA单独转染组细胞在p53的mRNA水平较溶剂对照组显著降低（P<0.01,论文中未列出）;Western Blot结果显示,p53 siRNA单独转染组细胞p53的磷酸化和非磷酸化蛋白表达水平均较溶剂对照组显著降低（P<0.01）。并且p53在mRNA和蛋白水平的有效抑制率均达到70%80%,证明p53 siRNA的转染成功地干扰了p53的表达。Western Blot结果显示,p53 siRNA+ST （3μM）处理组p-p53（Ser15）及p53的蛋白表达水平与ST （3μM）处理组相比均明显降低（P<0.05）;而与p53 siRNA处理组相比均显著升高（P<0.05）。提示,p53 siRNA的转染可以阻断ST诱导的GES-1细胞p53的激活。3.2.1.2 p53 siRNA转染对ST作用后GES-1细胞p21WAF1/CIP1蛋白的影响Western Blot结果显示,p53 siRNA+ST （3μM）处理组p21WAF1/CIP1的蛋白表达水平与ST （3μM）处理组相比明显降低（P<0.05）;而与p53 siRNA处理组相比均显著升高（P<0.05）。提示,p53 siRNA的转染可以阻断ST诱导的GES-1细胞p21WAF1/CIP1的激活。3.2.2 p53 siRNA转染对ST作用后GES-1细胞G2期关键调节因子表达变化的影响3.2.2.1 p53 siRNA转染对ST作用后GES-1细胞Cdc25C的影响Western Blot结果显示,p53 siRNA+ST （3μM）处理组与ST （3μM）处理组相比,Cdc25C的蛋白表达水平明显升高,而p-Cdc25C的水平则显著下降（P<0.05）。而p53 siRNA+ST （3μM）处理组p-Cdc25C的蛋白表达水平与p53 siRNA处理组相比有显著升高（P<0.05）。提示,p53参与了ST诱导的GES-1细胞Cdc25C表达的下调和p-Cdc25C表达的上调。3.2.2.2 p53 siRNA转染对ST作用后GES-1细胞Cdc2的影响Western Blot结果显示,p53 siRNA+ST （3μM）处理组与ST （3μM）处理组相比,Cdc2表达增多,而p-Cdc2表达则显著减少（P<0.05）;p53 siRNA+ST （3μM）处理组与p53 siRNA处理组相比,Cdc2表达水平有所降低,而p-Cdc2的表达水平则有显著升高（P<0.05）。提示,p53参与了ST诱导的GES-1细胞Cdc2表达的下调和p-Cdc2表达的上调。3.2.2.3 p53 siRNA转染对ST作用后GES-1细胞CyclinB1的影响Western Blot结果显示,p53 siRNA+ST （3μM）处理组CyclinB1的蛋白表达水平与ST （3μM）处理组相比有显著下降,而与p53 siRNA处理组相比则有显著升高（P<0.05）。提示,p53参与了ST诱导的GES-1细胞CyclinB1蛋白表达的上调。3.2.3 p53 siRNA转染对ST作用后GES-1细胞凋亡相关蛋白表达变化的影响3.2.3.1 p53 siRNA转染对ST作用后GES-1细胞Bcl-2的影响Western Blot结果显示,ST （3μM）处理组与溶剂对照组相比,Bcl-2的蛋白表达水平显著下降（P<0.05）;而p53 siRNA+ST （3μM）处理组与ST （3μM）处理组相比Bcl-2水平无明显变化（P>0.05）。提示,p53 siRNA转染不足以逆转ST对GES-1细胞Bcl-2表达的下调作用。3.2.3.2 p53 siRNA转染对ST作用后GES-1细胞Bax的影响Western Blot结果显示,p53 siRNA+ST （3μM）处理组Bax的蛋白表达水平与ST （3μM）处理组相比有显著下降,而与p53 siRNA处理组相比则有明显升高（P<0.05）。提示,p53参与了ST诱导的GES-1细胞Bax蛋白表达的上调。3.2.3.3 p53 siRNA转染对ST作用后GES-1细胞Caspase-3的影响Western Blot结果显示,p53 siRNA+ST （3μM）处理组在17kD处的Caspase-3活性酶切片段与ST （3μM）处理组相比明显减少,而与p53 siRNA处理组相比则有明显增加（P<0.05）。提示,p53参与了ST诱导的GES-1细胞caspase-3的激活。3.2.4 p53 siRNA转染对ST诱导的GES-1细胞G2期阻滞的影响FCM检测结果显示,与ST （3μM）处理组相比,p53 siRNA+ST （3μM）处理组G2/M期细胞比例明显降低（P<0.05）。表明p53 siRNA转染可以阻断ST诱导的细胞G2/M期比例增高,提示p53以及其下游信号转导通路的激活可能参与了ST诱导的细胞周期G2期阻滞。结论:1 ST可以抑制GES-1细胞增殖及诱导其发生G2期阻滞和凋亡,而ST可能正是通过诱导G2期阻滞和凋亡来抑制GES-1细胞增殖的。2 ST通过抑制Bcl-2和促进Bax蛋白表达来激活线粒体凋亡途径,随后激活caspase-3而最终诱导GES-1细胞发生凋亡。3 ST可以引起GES-1细胞DNA的损伤并激活损伤下游ATM/ATR信号通路。ATM/ATR特异性阻断剂可以阻断ST诱导的G2期阻滞。由此可见,ATM/ATR信号通路的激活可能参与了ST诱导的GES-1细胞G2期阻滞,且在这一过程中ST引起的DNA损伤是一个起始事件。4 ST可以激活p53-p21WAF1/CIP1信号转导通路,并且通过siRNA干扰p53基因的表达证实了p53-p21WAF1/CIP1信号通路的激活参与了ST诱导的GES-1细胞G2期阻滞和凋亡。5从ST的时间效应来看,ST引起的GES-1细胞凋亡的发生晚于其诱导的G2期阻滞,它们的效应高峰分别出现在ST作用后8天和4天。并且当ST持续作用12天时,G2期阻滞和凋亡均缓解。6 ST持续作用较长时间时（12天）,有部分细胞能够脱离由p53介导的G2期阻滞和凋亡而继续生长,但这些细胞仍携带着严重的DNA损伤信息,而这些细胞的继续复制、增殖则可能是ST致癌作用的分子机制之一。
论文目录
相关论文文献
- [1].ATM/p53通路在杂色曲霉素诱导人胃黏膜上皮细胞(GES-1)G_2期阻滞中的作用[J]. 中国病理生理杂志 2015(10)