菠萝（台农16号）遗传转化体系的建立以及白藜芦醇合成酶基因转化菠萝的研究

论文摘要

菠萝（Ananas comosus）是深受人们喜爱的热带、亚热带四大水果之一。由于用种子繁殖容易产生变异,目前生产上多采用无性繁殖。自上世纪70年代组织培养技术开始应用于菠萝以来,菠萝组培再生技术得到了极大发展,菠萝工厂化育苗效率得以大幅提高。转基因技术的发展为培育新的作物品种提供了新的途径,但在菠萝基因工程育种上,菠萝遗传转化效率低下成为制约菠萝基因工程育种的瓶颈,自Sripaoraya等（2001）首次报道得到抗除草剂转基因菠萝植株以来,该领域的研究进展甚为缓慢。 本论文建立了台农16号菠萝的再生和遗传转化体系,并将有望能提高菠萝附加值的白藜芦醇合成酶基因导入该品种,获得了相应的转基因植株。白藜芦醇（Resveratrol,RES）是一种存在于葡萄、花生等少数关联不强的植物的多酚类次生代谢产物,在植物、微生物相互作用中发挥重要的作用。它是由一分子香豆酰-CoA（coumaroyl-CoA）和三分子丙二酰-CoA（malonyl-CoA）在白藜芦醇合成酶（Resveratrol synthase, RS）的催化下缩合而成。RES还具有一些重要的生物生理活性,如抗氧化活性、植物雌激素活性等,是一种对人类健康具有重要意义的化合物,在临床上常用于抑癌、抗炎症,预防及治疗高血压、动脉硬化、骨质增生、更年期综合症等。 RS虽只存在于有RES合成的植物中,但其2种底物广泛存在于各种植物中,且只需一步反应即可合成RES,因此将RS基因导入异源植物使之表达,从而使该植物获得合成RES的能力具有很高的可行性。RS基因在异源植物中表达,一方面有望增强植物抗菌、抗逆境胁迫的能力,另一方面可有效改善植物的品质,提高其附加值。此外,还可以以植物为生物反应器生产RES,为RES产业提供新的原料来源。 本论文通过丛生芽以及愈伤组织诱导两条途径建立并优化了台农16号菠萝的再生体系,确定培养基pH值为4的液体培养为丛生芽扩繁的最佳条件;愈伤组织途径中,菠萝无菌苗叶片诱导愈伤的最佳培养基为,MS培养基添加2.0mg/l 2,4-D、1.5mg/l6-BA及0.1mg/l NAA;叶片外植体的最佳苗龄为7-8周。 本研究构建了分别以潮霉素抗性和ppt抗性为选择标记的RS基因的高效植物表达载体pC1PRS和pC3PRS。利用农杆菌介导法、基因枪介导法以及超声波介导法导入台农16号菠萝。其中,只有基因枪介导法获得了抗性植株。本研究进一步探讨了基因枪介导法中的各个因素对转化效率的影响。确定叶片外植体的最佳预培养时间为8d;叶片外植体的最佳高渗处理时间为轰击前2h,而丛生芽外植体的最佳高渗处理时间为轰击前9h;最优的轰击次数为每皿外植体轰击两次。 经PCR分析检测表明6株抗性苗为阳性植株,说明RS基因已整合到菠萝基因组中。RT-PCR分析检测表明有2株菠萝已在RNA水平表达了RS基因。

论文目录

• 第一章 前言
• 1.1 菠萝生物技术研究进展
• 1.1.1 菠萝
• 1.1.2 菠萝再生体系的建立
• 1.1.3 菠萝转化
• 1.1.4 前景展望
• 1.2 白藜芦醇及白藜芦醇合成酶
• 1.2.1 白藜芦醇的化学结构
• 1.2.2 白藜芦醇的生物合成
• 1.2.3 白藜芦醇合成酶转基因研究
• 1.3 白藜芦醇的生理生化作用
• 1.3.1 白藜芦醇抑癌作用机理
• 1.3.2 白藜芦醇作为植物雌激素
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 质粒
• 2.1.4 PCR引物由上海激康公司合成
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 培养条件
• 2.2 方法
• 2.2.1 菠萝再生体系的建立
• 2.2.2 基本分子生物学实验方法
• 2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 2.2.4 农杆菌感受态细胞的制备与转化
• 2.2.5 质粒提取
• 2.2.6 DNA片段的回收
• 2.2.7 酶切与连接
• 2.2.8 RNA的提取
• 2.2.9 反转录PCR
• 2.2.10 菠萝的遗传转化
• 2.2.11 鉴定转基因植株的DNA提取
• 2.2.12 转基因植株鉴定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 菠萝再生体系的建立
• 3.1.1 丛生芽途径
• 3.1.2 愈伤组织途径
• 1PRS及pC₃PRS的构建'>3.2 植物表达载体pC₁PRS及pC₃PRS的构建
• 3.2.1 中间载体pCAMBIA1301-pTΩ4A和pCAMBIA3301-pTΩ4A的构建
• 1PRs、pC₃PRS的构建'>3.2.2 植物表达载体pC₁PRs、pC₃PRS的构建
• 3.3 菠萝的遗传转化
• 3.3.1 叶片预培养时间对基因枪介导法转化率的影响
• 3.3.2 轰击前干燥处理对转化率的影响
• 3.3.3 轰击次数对叶片外植体转化率的影响
• 3.4 转基因菠萝的检测
• 3.4.1 转基因菠萝的PCR检测
• 3.4.2 转基因菠萝的RT-PCR检测
• 3.5 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历