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新型Hsp90抑制剂SNX-2112的抗肿瘤作用及机制

2020-12-11阅读(828)

新型Hsp90抑制剂SNX-2112的抗肿瘤作用及机制

论文摘要

SNX-2112是近年来开发的一种新型Hsp90抑制剂,课题组前期进行了临床前的药理学及毒理学研究,以及对K562、A375细胞的作用及机制研究,结果表明SNX-2112具有良好的抗肿瘤作用。本论文主要进行了如下几个方面的研究,包括：1、SNX-2112敏感肿瘤细胞株的筛选：通过MTT法检测了SNX-2112对正常细胞株、肿瘤细胞株和肿瘤多药耐药细胞株的生长抑制作用,选定MCF-7乳腺癌细胞为论文的主要研究对象。2、SNX-2112抑制MCF-7细胞生长的作用及机制：采用共聚焦、流式细胞术及免疫印迹等方法,从形态学、细胞周期、凋亡以及Hsp90客户蛋白等方面进行机制研究。3、SNX-2112激活MCF-7细胞的非折叠蛋白反应（UPR）：采用免疫染色-共聚焦分析及免疫印迹等方法,从内质网UPR相关蛋白的细胞定位及表达等方面进行机制研究。4、SNX-2112诱导胞内靶点蛋白Hsp90发生断裂：采用免疫印迹、共沉淀、质谱以及信号通路抑制剂干预等方法,阐述SNX-2112诱导自身靶点Hsp90发生断裂的前因后果。5、SNX-2112抑制MCF-7/ADR多药耐药细胞生长的作用及机制：采用MTT、共聚焦、原子力显微镜、流式细胞术和免疫印迹等方法,从细胞形态、表面形貌、凋亡、P-gp及联合用药等角度进行研究。结果表明,1、SNX-2112对L-02细胞的毒性较小,对肿瘤敏感细胞和多药耐药细胞都有较好的抑制作用。2、SNX-2112可诱导细胞发生G2期阻滞,激活线粒体途径的细胞凋亡,抑制关键客户蛋白HER2、Raf-1、Akt和Ikka的下调。3、SNX-2112可下调内质网二硫键异构酶体系的表达,下调GRP94的表达,上调GRP78的表达,激活内质网URP。4、SNX-2112可诱导细胞内靶点蛋白Hsp90发生中间结构域的断裂,半胱氨酸蛋白酶抑制剂可阻断Hsp90断裂的产生,并伴随着影响Hsp90客户蛋白的表达。5、SNX-2112虽然不影响MCF-7/ADR多药耐药细胞的P-gp表达,但可诱导细胞凋亡、S期阻滞、改变细胞表面形貌,且可与顺铂、阿霉素协同抑制MCF/ADR细胞的生长。结论：SNX-2112作为一种广谱、高效、低毒、可克服耐药的新型Hsp90抑制剂,具有诱导肿瘤细胞凋亡、周期阻滞、激活内质网UPR、诱导自身靶点断裂等作用机制,这些作用机制将为临床合理应用SNX-2112提供一定依据。

论文目录

  • 缩写词
  • 摘要
  • Abstract
  • 目录
  • 第一章 前言
  • 1.1 HSP90的结构与功能
  • 1.2 HSP90客户蛋白
  • 1.3 HSP90与肿瘤的关系
  • 1.4 HSP90抑制剂研究现状
  • 1.5 SNX-2112研究进展
  • 1.6 本论文研究内容
  • 第二章 SNX-2112敏感肿瘤细胞株的筛选
  • 2.1 仪器与材料
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 细胞培养
  • 2.2.2 生长抑制实验
  • 2.2.3 统计学分析
  • 2.3 结果与讨论
  • 2.3.1 SNX-2112对正常细胞的生长抑制作用
  • 2.3.2 SNX-2112对肿瘤细胞的生长抑制作用
  • 2.3.3 SNX-2112对肿瘤多药耐药细胞的生长抑制作用
  • 2.4 本章小结
  • 第三章 SNX-2112抑制人乳腺癌MCF-7细胞生长的作用及机制
  • 3.1 仪器与材料
  • 3.2 实验方法
  • 3.2.1 DAPI染色-共聚焦观察细胞核的变化
  • 3.2.2 PI单染-流式检测细胞周期分布
  • 3.2.3 Annexin V/PI双染-流式检测细胞凋亡
  • 3.2.4 Western-blot检测蛋白表达
  • 3.2.5 免疫染色-共聚焦观察蛋白质的细胞定位
  • 3.3 结果与讨论
  • 3.3.1 SNX-2112诱导MCF-7细胞发生凋亡
  • 3.3.2 SNX-2112激活MCF-7细胞的线粒体凋亡途径
  • 3.3.3 SNX-2112诱导MCF-7细胞发生G2/M期阻滞
  • 3.3.4 SNX-2112下调MCF-7细胞中Hsp90客户蛋白的表达
  • 3.4 本章小结
  • 第四章 SNX-2112激活人乳腺癌MCF-7细胞的非折叠蛋白反应
  • 4.1 仪器与材料
  • 4.2 实验方法
  • 4.2.1 免疫双标染色一共聚焦显微镜观察蛋白质的细胞定位
  • 4.2.2 Western-blot检测蛋白表达
  • 4.3 结果与讨论
  • 4.3.1 SNX-2112下调细胞核内Hsp90的表达
  • 4.3.2 SNX-2112下调胞浆"囊泡"内Hsp90的表达
  • 4.3.3 SNX-2112影响二硫键异构酶（PDI）的定位和表达
  • 4.3.4 SNX-2112下调内质网应激蛋白酶系（ERps）的表达
  • 4.3.5 SNX-2112下调GRP94的表达
  • 4.3.6 SNX-2112上调GRP78的表达
  • 4.4 本章小结
  • 第五章 SNX-2112诱导MCF-7细胞靶点蛋白HSP90断裂
  • 5.1 仪器与材料
  • 5.2 实验方法
  • 5.2.1 免疫共沉淀（co-IP）
  • 5.2.2 Western-blot检测蛋白表达
  • 5.2.3 质谱鉴定SDS-PAGE电泳的差异蛋白
  • 5.3 结果与讨论
  • 5.3.1 SNX-2112对MCF-7细胞内Hsp90表达的影响
  • 5.3.2 SNX-2112诱导MCF-7细胞产生Hsp90同源性片段
  • 5.3.3 SNX-2112所诱导的同源片段为Hsp90β中间结构域被剪切后的断裂片段
  • 5.3.4 SNX-2112诱导的Hsp90β断裂可被Caspase抑制剂阻断
  • 5.3.5 阻断Hsp90p断裂可影响Hsp90客户蛋白的表达
  • 5.4 本章小结
  • 第六章 SNX-2112抑制人乳腺癌MCF-7/ADR多药耐药细胞生长的作用及机制
  • 6.1 仪器与材料
  • 6.2 实验方法
  • 6.2.1 MTT法测定MCF-7/ADR细胞的耐药倍数
  • 6.2.2 DAPI染色-共聚焦观察细胞核的变化
  • 6.2.3 Western-blot检测蛋白表达
  • 6.2.4 流式细胞术检测P-gp的表达
  • 6.2.5 原子力显微镜（AFM）检测细胞表面超微结构的变化
  • 6.2.6 CDI法评价SNX-2112和阿霉素、顺铂的联用效果
  • 6.3 结果与讨论
  • 6.3.1 MCF-7/ADR细胞具有的多药耐药性
  • 6.3.2 MCF-7/ADR细胞对SNX-2112和阿霉素的耐药倍数
  • 6.3.3 SNX-2112影响MCF-7/ADR细胞的表面形貌
  • 6.3.4 SNX-2112诱导MCF-7/ADR细胞凋亡
  • 6.3.5 SNX-2112不影响MCF-7/ADR细胞的P-gp表达
  • 6.3.6 SNX-2112诱导MCF-7/ADR细胞的s期阻滞
  • 6.3.7 SNX-2112和顺铂、ADR具有协同作用
  • 6.4 本章小结
  • 第七章 全文总结
  • 参考文献
  • 附录
  • 博士期间撰写投寄论文
  • 致谢

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