人胰腺癌细胞系与大鼠背根神经节体外共培养的研究

论文摘要

目的:胰腺癌（pancreatic cancer,PanCa）是恶性程度很高的恶性肿瘤之一,早期即会发生淋巴管、血管、肝脏转移,预后极差。嗜神经浸润（perineural invasion,PNI）是胰腺癌的重要特征,并且与胰腺癌术后的腹膜后肿瘤复发有密切关系,是胰腺癌的独立预后指标之一,然而PNI的具体发生机制尚不清楚。Ayala等使用前列腺癌细胞系与大鼠背根神经节（dorsal root ganglion,DRGs）共培养建立了前列腺癌细胞/DRGs体外共培养模型,应用于前列腺癌嗜神经浸润的研究,证实前列腺癌嗜神经浸润是涉及到前列腺癌细胞与神经细胞或者胶质细胞主动的相互作用的过程。本研究的研究目的在于建立一种新的体外胰腺癌嗜神经浸润研究模型,并观察嗜神经浸润过程中神经突的生长状况、胰腺癌细胞的增殖、凋亡及迁移情况。方法:自4～6周龄Wistar大鼠的颈部、胸部和腰部取DRGs。人胰腺癌细胞系（MIA PaCa-2）常规培养后,取DRGs与人胰腺癌细胞系于Matrigel胶中共培养建立研究模型.倒置显微镜下于24h、48h、72h、96h、120h及144h观察胰腺癌细胞集落形成和DRGs神经细胞神经突生长情况以及胰腺癌细胞的迁移情况,并用Image-Pro Plus 5.0图像分析软件进行图像分析、神经突计数、计算神经突和胰腺癌细胞集落所占的面积。免疫细胞化学法检测胰腺癌细胞Ki-67增殖细胞核抗原表达情况,并计算胰腺癌细胞增殖率（proliferation index,PI）:MTT法检测吸光度值（A）,反映胰腺癌细胞的增殖情况。利用流式细胞仪检测胰腺癌细胞的凋亡率（apoptosis index.AI）。结果:背根神经节位于脊髓腹侧脊神经后根出椎管处,附着在后根,大小约1～2mm,呈浅黄色,圆形,表面光滑。共培养模型中神经细胞神经突生长明显优于对照组,72小时后,神经突所占据的面积约为对照组的2.57倍（P＜0.001）;共培养模型中MIA PaCa-2胰腺癌细胞集落生长速度也快于对照组,72小时后,细胞集落所占据的面积约为对照组的1.33倍（P＜0.001）。倒置显微镜下观察发现神经突有明显的向胰腺癌细胞集落方向生长的趋势,而神经突与胰腺癌细胞集落接触后,则出现胰腺癌细胞沿神经突生长的方向逆向迁移,最终到达背根神经节周围,出现类似PNI的表现。免疫细胞化学结果显示,上清液培养组中肿瘤细胞的Ki-67增殖细胞核抗原表达阳性率明显增高,实验组PI平均值为12.80±1.84%（9.8%～15.3%）,而对照组其PI平均值为6.81±0.73%（5.80%～8.3%）,差异有统计学意义（P＜0.001）。而MTT实验结果表明实验组吸光度远高于对照组,MTT与免疫细胞化学实验结果均表明实验组胰腺癌细胞的增殖远比普通培养基培养组中的胰腺癌细胞活跃。流式细胞仪检测结果表明,上清液培养组胰腺癌细胞凋亡率明显低于对照组,24小时培养后实验组胰腺癌细胞AI值为2.46±0.37%,而对照组AI值为4.89±0.63%,差异有统计学意义（P＜0.001）。结论:人胰腺癌细胞系（MIA PaCa-2）/DRGs共培养模型成功构建,有助于胰腺癌嗜神经浸润的研究。神经细胞-胰腺癌细胞的相互作用在胰腺癌的嗜神经浸润过程中发挥重要作用。神经细胞与胰腺癌细胞可以相互促进对方的生长,并且胰腺癌细胞有沿神经突生长的方向逆向向背根神经节方向迁移的趋势。许多细胞因子参与了这一过程,其分子机制有待于进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 对象和方法
• 一、大鼠背根神经节（dorsal root gnaglion，DRG）
• 二、人胰腺癌细胞系和大鼠DRGs培养
• 三、MAI PaCa-2/DRGs共培养模型建立和倒置显微镜观察
• 四、免疫细胞化学检测胰腺癌细胞的生长情况
• 五、MTT比色法检测不同培养基中胰腺癌细胞的增殖情况
• 六、流式细胞仪分析胰腺癌细胞凋亡率
• 七、统计学方法
• 结果
• 一、大鼠背根神经节（dorsal root ganglion，DRGs）
• 二、胰腺癌细胞集落和神经细胞神经突生长情况
• 三、免疫细胞化学方法检测MIA PaCa-2细胞的增殖情况
• 四、MTT检测胰腺癌细胞增殖情况
• 五、流式细胞仪检测胰腺癌细胞凋亡率
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 胰腺癌嗜神经浸润机制的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢