产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD启动子在酿酒酵母中的功能分析

论文摘要

产甘油假丝酵母WL2002-5具有耐高渗并且高产甘油的特性,已被广泛用于甘油的工业化生产。自实现工业化以来,为了进一步提高其产量性状,本中心着重在菌种和其关键酶表达以及发酵工艺等方面做了大量的工作,至今仍未取得实质性突破,最可能的原因是我们对其遗传背景知之甚少,亟待完善。为了进一步提高产甘油假丝酵母的产量性状,完善其遗传背景研究,阐明其高产甘油的机理,由于胞浆3-磷酸甘油脱氢酶是甘油合成途径中的关键酶,因此本课题组通过简并PCR技术首次从产甘油假丝酵母克隆到编码产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD,与酿酒酵母GPD1基因相比对,发现二者的同源性只有54.15%,表明产甘油假丝酵母的CgGPD基因是一个新的基因,因此弄清它的分子机理将可能为解释该菌株高转化率、高产甘油提供一个重要的依据,同时研究还发现CgGPD是一种渗透压调节基因,所以怀疑其启动子PCggpd受渗透压调控,故本研究根据已获得的CgGPD的相关序列设计引物,用PCR技术克隆出该基因的启动子PCggpd,通过比对发现该启动子与来自酿酒酵母GPD1的启动子在序列特征上存在明显差异,两者同源性仅有28.75%,说明PCggpd是一个全新的启动子。为了更好地对PCggpd的功能进行分析,本研究克隆了来自于水母的绿色荧光蛋白基因gfp,构建了含报告基因gfp的重组表达载体pYX212-zeocin-PCggpd-gfp,电击转入酿酒酵母W303-1A中,然后将重组型酿酒酵母置于含不同浓度的NaCl、KCl、葡萄糖、甘露醇、山梨醇等渗透压调节剂的YEPD培养基中进行培养,检测PCggpd启动报告基因gfp表达的差异。通过荧光检测表明,PCggpd不仅成功启动了gfp的表达,而且在不同渗透压条件下,gfp的表达存在明显差异。这主要是由于启动子PCggpd对不同渗透压的响应情况引起。在高渗条件下荧光蛋白表达明显增强,说明高渗条件对PCggpd具有很强诱导作用。从PCggpd受高渗条件诱导以及随着渗透压的提高诱导作用随之增强的特性可以看出PCggpd很可能是产甘油假丝酵母在高渗条件下高转化率、高产甘油的重要因素之一,这将对完善产甘油假丝酵母的遗传背景,阐明其高产甘油的机理具有重要意义。为了进一步验证启动子的PCggpd的功能,将诱导型启动子PCggpd在抗性育种和异源蛋白表达等方面得以应用,本研究进行了初步探索。首先克隆了不含信号肽的来自于枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶基因amy,构建了酿酒酵母游离型重组表达载体pYX212-zeocin-PCggpd-amy,即将α-淀粉酶基因amy置于产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD的启动子PCggpd的下游,通过电击转化法将重组表达载体导入酿酒酵母W303-1A中;将稳定遗传的阳性转化子,在YEPD和诱导培养基中培养,测定α-淀粉酶的酶活以及表达的差异,进一步证明了启动子PCggpd受渗透压诱导以及随渗透压的提高诱导作用随之增强的特性,同时也为启动子PCggpd在实际中得以应用奠定了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 甘油的性质及研究现状
• 1.1.1 甘油的理化性质及主要用途
• 1.1.2 甘油的生产方法
• 1.1.3 产甘油假丝酵母
• 1.1.4 甘油的合成途径
• 1.2 3-磷酸甘油脱氢酶基因的性质及研究现状
• 1.3 启动子的性质、分类及研究现状
• 1.4 报告基因
• 1.5 3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子的研究现状
• 1.6 本研究的立题背景和内容
• 第二章 产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD启动子的克隆及酵母表达载体的构建
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 工具酶与试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 产甘油假丝酵母染色体 DNA 的制备
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.1.6 PCR 扩增反应体系及反应条件
• 2.1.7 PCR 产物胶回收
• 2.1.8 质粒 DNA 的提取
• 2.1.9 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.10 转化大肠杆菌
• 2.1.11 酿酒酵母感受态的制备
• 2.1.12 电击转化酿酒酵母
• 2.1.13 稳定转化子的筛选
• 2.1.14 绿色荧光蛋白的检测
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 启动子 PCggpd 的克隆和测序
• 2.2.2 含有报告基因gfp 的酵母表达载体pYX212-zeocin-PCggpd-gfp 的构建
• 2.2.3 对照重组质粒pYX212-zeocin -gfp 的构建
• 2.2.4 酿酒酵母阳性转化子的获得及初步鉴定
• 2.2.5 重组酿酒酵母 S. cerevisiae W303-1A–GFP 荧光检测
• 2.3 本章小结
• 第三章 利用绿色荧光蛋白研究产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD启动子的功能
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 渗透压调节剂及其浓度
• 3.1.4 酿酒酵母阳性转化子发光特性和荧光强度的检测
• 3.2 结果
• 3.2.1 不同浓度的 NaCl 对启动子 PCggpd 的诱导作用
• 3.2.2 不同浓度的 KCl 对启动子 PCggpd 的诱导作用
• 3.2.3 不同浓度的葡萄糖对启动子 PCggpd 的诱导作用
• 3.3 本章小结与讨论
• 第四章 PCggpd调控枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因amy在酿酒酵母中的表达
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌种与质粒
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 工具酶与试剂
• 4.1.4 枯草芽孢杆菌染色体 DNA 的制备
• 4.1.6 PCR 扩增反应体系及反应条件
• 4.1.7 PCR 产物胶回收
• 4.1.8 质粒的提取
• 4.1.9 大肠杆菌感受态的制备
• 4.1.10 转化大肠杆菌
• 4.1.11 酿酒酵母感受态的制备
• 4.1.12 电击转化酿酒酵母
• 4.1.13 稳定转化子的筛选
• 4.1.14 粗酶液的制备
• 4.1.15 α-淀粉酶的酶活力测定
• 4.1.16 蛋白质含量测定
• 4.2 结果和讨论
• 4.2.1 含有α-淀粉酶基因amy的酵母表达载体pYX212-zeocin-PCggpd-amy的构建及其酶切验证
• 4.2.2 对照重组质粒pYX212-zeocin -amy 的构建
• 4.2.3 酿酒酵母阳性转化子的获得及初步鉴定
• 4.2.4 酿酒酵母阳性转化子α-淀粉酶的酶活测定
• 4.3 本章小结
• 主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文